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Endoplasmic reticulum–plasma membrane contact gradients direct cell migration

Endoplasmic reticulum–plasma membrane contact gradients가 direct cell migration을 유도합니다.

Endoplasmic reticulum–plasma membrane contact gradients direct cell migration

Abstract

Directed cell migration은 intracellular signaling의 front–back polarization에 의해 주도됩니다. Receptor tyrosine kinases 및 other inputs은 activate local signals를 활성화하여 membrane protrusions을 front에서 촉발시킵니다. 마찬가지로 중요한 것은 multiple fronts가 형성되는 것을 방지하기 위해 back에서 신호를 억제하는 long-range inhibitory mechanism입니다. 그러나 이 메커니즘의 정체가 밝혀지지 않았습니다.

여기에서는 endoplasmic reticulum–plasma membrane (ER-PM) contact sites가 단일 및 집단적으로 migrating cells에서 polarized되어 있음을 보고합니다. back에서 이러한 ER-PM contact sites의 밀도가 증가하면 ER에 상주하는 PTP1B phosphatase가 PM substrates에 더 많이 접근하여 receptor signaling을 front로 제한하고 directs cell migration을 유도할 수 있습니다. ER-PM contacts의 polarization은 microtubule-regulated polarization of the ER로, front에는 RTN4-rich curved ER이 더 많고 back에는 CLIMP63-rich flattened ER이 더 많습니다. 그 결과 ER curvature gradient는 front에서만 작고 불안정한 ER-PM contacts를 형성합니다. 이러한 contacts는 backwards로 흐르면서 back에서 크고 안정적인 contacts로 성장하여 front–back ER–PM contact gradient를 형성합니다.

이 연구를 종합하면 ER–PM contact gradients에 의해 매개되는 structural polarity가 cell signaling polarizes시키고 directs cell migration을 유도하며 cell migration을 연장시킨다는 것을 알 수 있습니다.

Figures

Polarized ER–PM contacts

– migrating cells에서 ER-PM contact sites가 polarized될 수 있는지 확인.

– endogenous ER-PM contact sites의 분포를 directly tracking.

Fig. 1: Migrating cells은 ER-PM contact density의 back-to-front gradients가 안정적.

a, ER-PM contact reporter MAPPER의 모식도.

b, d와 e의 single cells에서 다양한 시간에 따른 MAPPER (ER-PM contact marker)/CAAX (PM marker) 및 MAPPER/SEC61β (ER marker).

c, 24개 세포의 그룹 평균 MAPPER/CAAX 및 MAPPER/SEC61β.

d,e, 왼쪽, MAPPER-mVenus(청록색)를 안정적으로 발현하는 대표적인 RPE-1 세포와 mTurquoise-CAAX(노란색)(d) 및 iRFP-SEC61β(자홍색)를 20분 간격으로 캡처한 이미지 (e).

가운데, MAPPER/CAAX 비율 및 MAPPER/SEC61β 비율 컬러 이미지.

오른쪽, 시간 경과에 따른 back-to-front intensity ratio의 kymographs (시간 간격 2분).

f,g, migrating cell의 front (f) 및 back (g)에서 ER 및 PM의 Cryo-ET 분할 및 3D 렌더링. MCS는 ER과 PM 사이의 거리가 40nm 이내 부위.

h, front ER과 back ER의 ER-PM contact area의 Surface-area-weighted histogram.

i, wound closure assay에서 mTurquoise-CAAX 및 MAPPER-mVenus를 안정적으로 발현하는 RPE-1 세포의 이동 Time-course.

[Figure 1A] ER–PM contact reporter MAPPER는 amino-terminal signal peptide에 의해 ER에 고정되어 있으며, carboxy-terminal polybasic motif를 통해 PM의 negatively charged lipids와 reversibly binds한다.

[Figure 1B-E] 전체 ER-PM contact area density는 양극화된 분포를 보였으며, front의 ER-PM contact area density는 낮고 back의 밀도는 높음.

[Figure 1B,C] PM 또는 ER 마커를 통해 ER-PM contact gradient를 확인했을 때도 동일한 분포를 보임.

[Figure 1D,E] kymograph를 통해서도 ER-PM contact gradient가 migrating cells에서 안정적이라는 것을 보여줌.

[Figure 1F-H] front ER에 비해 back PM 근방에 약 12배 더 많은 ER이 존재하는 것으로 나타남.

[Figure 1I] wound healing assay에서 collective cell migration 중에 leader and follower RPE-1 cells모두에서 ER-PM contact gradients가 관찰됨.

– migrating cell은 front에는 작은 ER-PM contacts이 있고 back에는 큰 ER-PM contacts이 있으며, front의 전체 contact area density가 훨씬 낮음.

Role of ER–PM contact gradients

– ER-PM contact gradients가 세포 이동을 조절하는지 확인.

Fig. 2: MAPPER gradients는 pTyr 신호를 front로 제한하여 direct cell migration을 유도.

a, optogenetics tool의 개략도.

b, illumination 전과 illumination 중 세포 이동(2초마다 반복).

c, illumination에 의해 이동 방향이 역전된 세포의 비율.

d, 평균 MAPPER/CAAX 기울기와 개별 세포의 평균 세포 속도의 Scatter plot.

e, 이동하는 RPE-1 세포의 pan-Tyr 염색. 오른쪽, pTyr/CAAX 비율 및 MAPPER/CAAX 비율 이미지.

f, pTyr/CAAX 기울기와 비교한 평균 MAPPER/CAAX 기울기.

  1. 20ng µl-1 EGF 자극 후 control(NC), ESYT1 또는 ESYT2 siRNA를 transfected시킨 RPE-1 세포의 MSD 분석.

h, g에서 평균 세포 속도의 Frequency distribution.

i, control, ESYT1 또는 ESYT2 siRNA로 transfected된 RPE-1 세포가 이동시 pTyr/CAAX ratio gradient.

[Figure 2A] ER-localized CRY2–SEC61β–mCherry와 PM-localized CAAX-CIBN-iRFP를 발현시킴. ER과 PM 사이의 거리가 가까워져 CIBN과 CRY2가 interaction시 청색광이 발광.

[Figure 2B] 초기에 세포는 왼쪽으로 이동중임. front 영역(왼쪽)에서 청색광이 활성화된 후, CRY2–SEC61β–mCherry-positive 점의 수가 점차 증가하여 ER-PM contacts이 증가하고 있음을 확인. 특히, 세포의 왼쪽에 ER-PM의 contacts이 형성됨에 따라 초기 front(세포의 왼쪽)의 막 돌출부가 점차 줄어들고 원래 back(오른쪽)에 작은 새 돌출부가 나타나기 시작함. 이 과정은 궁극적으로 세포 이동의 반전으로 이어짐.

[Figure 2C] 이 turning behaviour에 대한 통계적 분석.

– 따라서 ER-PM contact gradients는 cell migration direction을 제어할 수 있습니다.

[Figure 2D] 정량적 분석 결과 ER-PM contact gradients의 기울기는 RPE-1 세포마다 다르며 세포 이동 속도와 양의 상관관계가 있는 것으로 나타남.

[Figure 2E] pan-pTyr 신호(녹색)와 ER-PM contact density(자홍색)의 기울기를 직접 비교한 결과, 음의 상관관계가 있는 것으로 나타남.

[Figure 2E,F] 이 결과는 ER-PM contact gradients의 기울기가 polarized signalling의 가파른 정도를 조절하고, 이는 다시 이동 속도를 조절한다는 가설을 뒷받침.

[Figure 2G,H] ESYT1 또는 ESYT2의 knockdown은 EGF-mediated migration speed를 감소시킴.

[Figure 2I] 특히, ESYT1과 ESYT2를 knockdown하면 front-to-back pan-pTyr signal gradient가 감소했으며, back에서 유의미한 팬-pTyr 신호가 증가함.

– 따라서 ER-PM contact gradients는 back에서 pTyr 신호를 억제하여 이동 방향과 속도를 조절하는 것으로 보임.

Polarized PTP1B activity

– ER-resident tyrosine phosphatase PTP1B는 PM에서 substrates와 직접 상호 작용하여 ER에서 PM으로 신호를 보낼 수 있음.

– PTP1B가 pTyr 분포를 polarizing하는 역할을 하는지 테스트.

– 이전 연구에서는 ER-localized PTP1B가 그 substrates 중 하나인 EGFR을 PM에서 dephosphorylate 할 수 있다고 제안.

– PTP1B와 EGFR 간의 상호 작용이 세포에서 polarized 되는지 여부를 확인.

Fig. 3: PTP1B-mediated phosphatase activity는 asymmetric pTyr 신호에 필요.

a,b, 10µM DMSO 또는 PTP1B inhibitor CAS765317-72-4(PTP1Bi)(a) 또는 alternative PTP1B inhibitor MSI-1436(MSI)(b)로 처리한 RPE-1 세포의 대표적인 MAPPER/CAAX 및 pTyr/CAAX 비율 이미지.

c,d, DMSO, PTP1Bi 또는 MSI로 처리한 RPE-1 세포에서 MAPPER/CAAX(c) 및 pTyr/CAAX 비율(d) 기울기 비교.

e,f, 표시된 농도에서 20ng µl-1 EGF와 함께 DMSO 또는 PTP1Bi로 자극한 세포의 평균 속도 분포(e) 및 MSD(f).

g, ER-localized PTP1B와 PM- localized substrates의 상호작용 모식도.

h, RPE-1 세포에서 local PTP1B-EGFR complementation signals 및 MAPPER signals의 대표 이미지.

 

* selective PTP1B allosteric inhibitors : CAS765317-72-4, MSI-1436

CAS765317-72-4 : PTP1B의 WPD loop closure을 억제

MSI-1436 : PTP1B의 disordered C terminus를 표적

[Figure 3A-D] PTP1B inhibitors 처리시 pan-pTyr 신호가 고르게 분포.

[Figure 3C] 세포를 inhibitors로 25분 동안 처리해도 ER-PM contact signal gradient는 크게 변하지 않음을 확인.

[Figure 3E,F] PTP1B inhibitors를 처리했을 때 dose dependent하게 cell speed가 감소하는 것을 확인.

– 이러한 결과는 PTP1B activity가 세포 이동을 촉진하기 위해 RTK 신호를 polarization한다는 것을 시사.

[Figure 3G] bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay

PTP1B substrate-trapping mutant form PTP1B(D181A)의 N 말단에 YFP(eYFP)의 YC fragment (residues 155~238)를 붙이고, EGFR의 C 말단에 eYFP의 YN fragment (residues 1~154)를 붙임. PTP1B과 EGFR이 interaction을 한다면, YFP를 통해 형광을 띔

[Figure 3H] YC-PTP1B(D181A)와 EGFR-YN은 migrating cells의 back에서 특이적으로 상호 작용하는 것을 확인. 또한, complemented local eYFP signal은 ER-PM contact reporter와 colocalized됨.

– 이러한 결과를 종합하면, back에 훨씬 더 높은 밀도의 ER-PM contacts가 있으며, ER-resident PTP1B가 ER-PM contacts에서 PM-localized substrates와 상호 작용하여 back에서 선택적으로 RTK 신호를 억제하는 모델을 뒷받침함.

Retrograde ER–PM contact flow

– 세포가 depolarization과 repolarization을 겪을 때 ER-PM contact gradients가 어떻게 동적으로 변화하는지 테스트.

– migrating cells의 front와 back에 있는 ER-PM contacts의 growth rate 비교.

Fig. 4: migrating cells front의 ER-PM contacts의 retrograde flow과 slow contact growth rate.

a, 이동하는 RPE-1 세포에서 t = 0분 및 t = 10분에 extracellular matrix에 고정된 MAPPER 분포(ER-PM 접촉을 나타냄)의 대표 이미지.

b, 왼쪽, 가운데, 이동하는 세포(흰색, 세포 경계)에 대한 MAPPER 점의 flow field displacement vectors (노란색).

오른쪽, 왼쪽 이미지의 녹색 선에서 ER-PM contact 안정성의 kymograph.

c, fibronectin stripes 끝에서 이동 방향을 역전하는 RPE-1 세포의 MAPPER/CAAX 비율과 MAPPER/SEC61β 비율의 대표적 시간 경과 이미지.

d,e, c에서 세포의 MAPPER/CAAX(d) 및 MAPPER/SEC61β(e) 변화의 kymograph

f, 이동 방향 역전 중 MAPPER 기울기 프로파일 변화.

g, extracellular matrix에 대한 MAPPER 점 displacement의 정량화.

h, 앞쪽과 뒤쪽의 MAPPER 점의 Growth rate.

i, migrating cells의 front와 back의 ER-PM 접점 성장률의 평균 기울기.

[Figure 4A] 이동중인 세포의 individual ER–PM contacts는 시간에 따라 변하지 않음. 이는 cortical actin과 마찬가지로 extracellular matrix에 고정되어 있음을 의미하며, 세포의 net forward movement와 대조됨.

[Figure 4B] migrating cells의 관점에서 actin filaments와 ER-PM contacts은 모두 retrograde flow를 보임.

[Figure 4C-F] Fibronectin stripes 끝에 도달하여, 이동 방향이 변화하는 세포를 분석

Kymograph 및 time-course analysis 결과, 세포가 끝에 도달하여 회전하기 전인 paused state에서 MAPPER 기울기가 현저하게 재구성된 것을 확인.

이 paused state 동안, 세포가 수축하는 원래의 back (사진상 위쪽)에서 MAPPER density가 감소함에도 ER-PM contacts의 위치는 변하지 않음.

전 back (사진상 위쪽)에서 새로운 돌출이 생성되기 시작하면서(돌출은 t = 60분에서 발생), 이전 front(사진상 아래쪽)에서 ER-PM contact density는 계속 증가함. 반면, 이전 back (사진상 위쪽)에 남아있던 ER-PM contacts은 새로운 back (사진상 아래쪽)을 향한 retrograde flow를 보임.

– 따라서 local ER–PM contact formation 및 flow의 slow dynamics는 ER-PM contact gradients의 slow reversal 및 directed cell migration의 지속성을 설명함.

[Figure 4G] ER-PM contacts이 extracellular matrix에 비해 고정되어 있다는 사실을 이용하여 growth rate 측정.

[Figure 4H,I] 상대적인 ER-PM contacts 위치(0은 세포 front, 1은 back을 나타냄) 의 함수로, ER-PM contact density가 세포의 front 절반에서는 천천히 증가하지만 back 절반에서는 3배 더 높은 growth rate을 보임.

– 이 결과는 ER-PM contacts의 growth rate이 전면에서 억제된다는 것을 시사.

Polarized ER curvature during migration

– migrating cells에서 curved 및 flattened ER의 공간적 분포를 조사.

– ER membrane curvature gradient가 ER-PM contact gradients를 연관있는지 확인.

Fig. 5: curved 및 flattened ER의 polarized organization을 통한 ER-PM contact gradients 제어.

a, curved 및 flattened ER 형태 모식도

b,c, 이동하는 RPE-1 세포에서 doxycycline-induced RTN4–mCherry (b의 녹색) 또는 CLIMP63-mCherry(c의 녹색) 및 SEC61β-iRFP(자홍색)의 분포도.

d, 평균 RTN4/CLIMP63 비율(ER curvature의 척도)과 MAPPER/SEC61β 비율의 기울기 비교.

e,f, stripes를 따라 이동하는 세포의 front (e)과 back (f)에서 ER과 PM의 Cryo-ET 분할 및 3D 렌더링. MCS는 ER과 PM 사이의 거리가 40nm 이내 부위.

g, membrane curvature을 비교한 front 및 back ER의 Surface morphometric analysis.

h, control (NC), RTN4 또는 CLIMP63 siRNA(48시간 동안)로 transfected된 RPE-1 세포의 MAPPER/CAAX 비율 이미지.

i, control, RTN4 또는 CLIMP63 siRNA로 transfected된 세포의 정규화된 MAPPER/CAAX 프로파일.

j, ER-PM contact gradients가 관찰된 pTyr 신호의 기울기를 생성하는 방법의 모델.

[Figure 5A] reticulon member인 RTN4는 curved ER에 풍부하게 존재하는 ubiquitous curvature-shaping protein이며, CLIMP63은 luminal ER spacer 역할을 하며 flattened ER sheets에 풍부하게 존재함.

[Figure 5B] RTN4-marked curved ER tubules은 migrating cells의 front에서 상당히 enriched된 것을 확인.

[Figure 5C] 이와 대조적으로, CLIMP63-marked flattened ER sheets는 back에서 상당히 풍부함.

[Figure 5E,F] cryo-ET 이미지를 3d rendering한 결과, front에는 더 많은 curved ER tubules이 있고 back에는 flattened ER sheets가 있음을 확인.

[Figure 5G] Surface morphometric analysis 결과, front의 ER이 back보다 약 2.23배 더 curved되어 있는 것을 확인.

– 이러한 데이터를 종합하면, migrating cells가 ER network의 curvature을 조절하여 front에는 고도로 curved ER tubules이 풍부하고 back에는 flattened sheet-like ER이 형성된다는 것을 알 수 있음.

[Figure 5D] front–back의 RTN4/CLIMP63 비율의 개형은 ER-PM contact gradients의 반전된 모양과 밀접하게 일치.

[Figure 5H] CLIMP63 knockdown은 ER-PM contacts의 밀도와 크기를 감소시킴. 이는 앞서 본 CCLIMP63-enriched ER이 ER-PM contacts의 형성을 지원하는 역할과 일치.

대조적으로, RTN4 knockdown은 훨씬 더 많은 ER-PM contacts을 초래했으며, 이는 tubular ER이 ER-PM contacts을 억제하는 역할과 일치.

[Figure 5I] 두 경우 모두, ER-PM contacts의 기울기와 이동 속도가 감소함. 이는 세포 이동을 촉진하는 것은 contacts의 size가 아니라 ER-PM contacts의 기울기라는 가설을 뒷받침함.

perinuclear ER-localized sheet ER proteins인 CLIMP63, P180 및 KTN1은 다양한 유형의 Microtubules와 상호 작용할 수 있으며, 이는 MT가 back의 flattened ER을 안정화하는 데 추가적인 역할을 할 수 있음을 시사.

실제로 KTN1의 knockdown은 CLIMP63의 knockdown과 유사하게 ER-PM contact gradients를 감소시켰지만, P180의 knockdown은 큰 변화를 초래하지 않음.

– 이러한 결과는 ER의 polarized organization이 back의 ER sheet proteins과 MT 결합을 필요로 한다는 생각을 뒷받침함.

Summary

이러한 결과를 종합하면 ER의 조직과 상대적 구성이 세포 이동에 중요하다는 것을 알 수 있다. 즉, flattened sheet-like ER은 ER-PM contacts의 형성에 유리한 반면, migrating cells의 front에 있는 ER tubules의 high membrane curvature는 front의 ER-PM contacts이 불안정하고 작은 사이즈로 형성한다. 우리의 결과는 ER-PM contact gradients의 가파른 정도를 제어하는 것이 ER curvature gradient이며, 이는 다시 signaling gradient, migration speed 및 migration direction을 제어한다는 것을 시사.

Disscussion

우리의 연구는 migrating cells에서 ER-PM contact density와 size의 gradient를 확인했습니다(Figure 5j). ER-PM contact gradients의 가파른 정도는 이동 속도에 비례했으며, ER-PM contact gradients의 loss는 세포 이동을 억제했습니다. Rapidly하고 locally하게 변화할 수 있는 signaling 및 actin machineries과 달리, ER-PM contact gradients는 이동이 멈춘 후에야 서서히 소실되어 이전 이동 방향에 대한 기억을 제공함으로써 보다 안정적입니다. 또한, 이동이 멈춘 세포는 ER-PM contact gradients를 새로운 back으로 재조정해야만 새로운 방향으로 이동하기 시작합니다. 우리의 연구는 migrating cells에서 안정적인 ER-PM contact gradients를 보장하는 두 가지 중요한 메커니즘이 있다고 주장합니다: (1) 성장하는 ER-PM contacts의 retrograde flow와 (2) ER curvature gradient에 의해 부여된 front and back의 ER-PM contacts의 growth rate differences.

back의 ER-PM contacts에서 RTK signalling의 PTP1B-mediated suppression에 대한 우리의 발견 외에도, ER-PM contact gradients는 신호 메커니즘을 polarizing시키고 세포 이동을 지시하는 데 추가적인 역할을 할 수 있습니다. 예를 들어, back의 ER-PM contact density가 높을수록 이동하는 면역, 상피 및 기타 세포의 back에서 더 높은 basal Ca2+ 수준을 설명할 수 있습니다. 이러한 세포의 장기적인 Ca2+ gradients는 주로 ER-PM contacts에서만 발생하는 STIM–ORAI-mediated Ca2+ influx에 의해 조절되며, 우리는 이제 Ca2+가 세포로 유입되는 이러한 ER-PM contact sites가 back에 더 풍부하다는 것을 보여줍니다. back의 Ca2+ 수치가 높으면 myosin activation과 actin filament contraction이 촉진되어 세포가 세포의 back 방향을 잡는 데 도움이 됩니다. ER-PM contacts는 또한 phosphatidylinositol과 cholesterol lipids의 local transport sites이며 phosphatidylinositol의 polarization은 세포 이동 중 세포의 polarization에도 기여합니다. ER-PM contact gradients가 phosphoinositides의 polarization에 기여하는지 여부를 알아보는 것은 흥미로울 것입니다. 우리의 데이터를 종합하면 ER-PM contact gradients는 receptor signalling을 front으로 제한하여 세포 이동을 유도하고 persistent polarization을 위해 back에 additional fronts가 형성되는 것을 방지하는 것으로 나타났습니다.

REF

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