TERT의 clonal inactivation는 stem cell competition을 손상시킵니다.
Abstract
Telomerase는 chromosome ends을 보호하는 nucleoprotein caps인 telomeres를 촉매로 연장하기 때문에 줄기세포 및 암과 밀접한 관련이 있습니다. Telomerase reverse transcriptase (TERT)의 과발현은 telomere와 무관한 방식으로 세포의 증식을 촉진하지만, 지금까지 loss-of-function 연구에서는 TERT가 줄기세포 기능에 직접적인 역할을 한다는 증거는 발견되지 않았습니다.
많은 조직에서 항상성은 stem cell competition에 의해 형성되는데, 이는 줄기세포가 내재된 적합성을 기반으로 경쟁하는 과정입니다. 여기에서는 마우스의 spermatogonial stem cell (SSC)-containing population에서 Tert의 conditional deletion이 competitive clone formation을 현저하게 손상시킨다는 사실을 보여줍니다. Tert locus의 lineage tracing을 통해 TERT-expressing SSC는 수명이 긴 클론을 생성하지만, TERT의 clonal inactivation은 stem cell differentiation와 open chromatin의 genome-wide reduction을 촉진한다는 것을 발견했습니다. competitive clone formation에서 TERT의 이러한 역할은 reverse transcriptase activity와 canonical telomerase complex와는 독립적으로 발생합니다. TERT의 비활성화는 MYC oncogene의 활성을 감소시키고, TERT-deleted SSC 풀에서 MYC의 transgenic expression은 clone formation을 효율적으로 구제합니다.
이러한 데이터를 종합하면 stem cell competition을 강화하는 데 있어 TERT의 catalytic-activity-independent requirement를 밝히고, TERT와 MYC 간의 유전적 연관성을 밝혀내며, 높은 수준의 TERT를 가진 줄기세포의 선택적 이점이 항상성과 노화 과정에서 male germline의 telomere 연장에 기여한다는 것을 시사합니다.
Figures
Clone formation from TERT+ SSCs
– TERT-expressing spermatogonia를 기능적으로 연구
Fig. 1: TERT 삭제 시 SSC-mediated clone formation이 손상.
a, TertCreER/+Rosalsl-Tdtomato/+ mice.
b, Tert-CreER의 Lineage tracing.
c, tamoxifen 1mg 처리 3개월 후 testis에서 untangled seminiferous tubules의 tdTomato 및 bright-field image.
d-f, 표시된 시간 동안 표시된 용량의 tamoxifen으로 pulse labelling 후 평균 패치 수(d) 평균 패치 길이(e) 및 총 패치 길이(f)를 비교.
[Figure 1a] tamoxifen-dependent CreER 시스템을 통해 TERT-expressing cells이 tdTomato로 염색되는 모델.
[Figure 1b] self-renewal activity가 높은 SSC는 long-lived tdTomato+ clones들을 형성하여 patch처럼 염색되어 보임. 반면 differentiation하는 SSC는 small transient clone만 형성하여 거의 보이지 않음.
[Figure 1c] 3개월 후, TERT+ 세포를 표지하면 라벨링된 패치가 생성된 반면, tamoxifen을 주입하지 않은 대조군에서는 패치가 생성되지 않음.
[Figure 1d] 투여된 tamoxifen의 용량을 0.25mg에서 4mg으로 변화시켰을 때, 패치 수는 용량 의존적으로 증가.
[Figure 1e] 패치 길이는 1mg 미만의 용량에서는 일정하게 유지되었지만, 2mg 이상의 용량에서는 증가함.
– 이는 고용량으로 인해, 독립적으로 표지된 두 개의 클론이 융합되었음을 반영.
[Figure 1d-f] 1mg tamoxifen으로 치료하고 1년간 추적한 마우스에서는 3개월 동안 추적한 마우스에 비해 패치 길이는 증가했으나, 패치 수가 감소함. 총 tdTomato+ 패치 길이(평균 패치 수×평균 패치 길이)는 일정하게 유지되었는데, 이는 이전에 설명한 라벨이 없는 클론과의 확률적 경쟁과 일치.
– 이러한 데이터를 종합하면, TERT-expressing SSC는 수명이 긴 클론을 생성하고 줄기세포 풀 내에서 경쟁을 보인다는 것을 알 수 있음.
Impaired clone formation with TERT loss
– SSC에서 TERT의 직접적인 역할을 조사
Fig. 1: TERT 삭제 시 SSC-mediated clone formation이 손상.
g, TertCreER/flox:Rosalsl-Tdtomato/+ mice.
h, whole-mount seminiferous tubules을 사용한 GFRA1 및 tdTomato의 Immunofluorescence (2일차).
i, GFRA1+ As 및 Apr 세포 중 tdTomato+ 세포의 정량화.
j, tamoxifen 처리 5일 후 정제된 tdTomato+ US에서 Tert mRNA에 대한 In situ hybridization.
k, Tert mRNA의 foci quantification.
l, tamoxifen 처리 후 3개월 및 6개월 후 엉키지 않은 untangled seminiferous tubules에서 tdTomato의 Epifluorescence.
m-o, 평균 패치 수(m), 평균 패치 길이(n) 및 총 패치 길이(o)의 정량화.
* US : undifferentiated spermatogonia.
testis에서 SSC는 US라고 하는 기능적, 형태학적으로 heterogeneous population에 존재.
** As : Singly isolated US
*** Apr : paired connected US
As US는 불완전한 세포분열을 거쳐 점차적으로 길쭉한 사슬 형태의 Apaired 및 Aaligned(Aal: 4개(A4), 8개(A8) 또는 16개(A16) 연결된 US를 생성.
[Figure 1g] CreER을 activation시키면 tdTomato 라벨링되며 동시에 Tert를 비활성화. 이를 통해 대부분의 세포가 TERT 발현하는 환경에서 Tert가 일부 삭제된 SSC-derived 세포 클론의 운명을 추적.
[Figure 1h,i] tamoxifen 1mg으로 처리한 지 이틀 후, TertCreER/+ 및 TertCreER/flox 마우스 모두에서 GFRA1+ As 및 Apr 클론이 구분할 수 없을 정도로 표지됨.
[Figure 1j,k] Pulse labelling은 tdTomato+ US에서 Tert mRNA를 효율적으로 제거.
[Figure 1l,n] 3개월 및 6개월 시점에서 TERT를 삭제하면 tdTomato+ 클론 수가 현저하게 감소하고 평균 패치 길이가 감소.
[Figure 1o] 이에 따라 총 tdTomato+ 패치 길이도 급격히 감소.
– 이러한 발견을 종합하면, SSC의 하위 집합에서 TERT의 focal deletion이 경쟁 과정을 통해 clonal formation을 손상시킨다는 것을 알 수 있습니다.
A role independent of catalytic activity
– SSC 경쟁을 강화하는 TERT의 효과가 telomeres 연장에 대한 촉매 역할에 의존하는지 확인
– telomerase complex 형성이 TERT-dependent SSC clonal formation에 필요한지 확인
– stem cell competition에 TERT의 reverse transcriptase activity가 필요한지 확인
Fig. 2: TERT는 telomerase complex 및 TERT catalytic activity와 무관하게 SSC 경쟁을 촉진.
a, TertCreER/flox:Rosalsl-Tdtomato/+:Terc−/− mice.
b, 처리 후 3개월 후 untangled seminiferous tubules에서의 tdTomato에 대한 Epifluorescence.
c-e, 평균 패치 수(c), 평균 패치 길이(d) 및 총 패치 길이(e)의 정량화.
f, TertCreER/flox:Rosalsl-Tdtomato/lsl-tTA:TetO-Tert or -Tertci mice.
g, tamoxifen 처리 후 3개월 후 untangled seminiferous tubules 에서의 tdTomato에 대한 Epifluorescence.
h-j, 평균 패치 수(h), 평균 패치 길이(i) 및 총 패치 길이(j)의 정량화.
[Figure 2a] Terc는 telomere addition을 위한 RNA 템플릿을 암호화하고 telomerase complex의 조립을 위한 central scaffold 역할. 따라서 Terc가 없으면 TERT와 telomerase의 다른 구성 요소는 결합하지 않음. telomerase complex 형성이 TERT-dependent SSC clonal formation에 필요한지 확인하기 위한 creER 마우스 모델.
[Figure 2b-e] 마우스에서 telomerase activity가 없음에도 불구하고, Terc여부와 상관없이 Tert conditional deletion은 패치 수, 패치 길이 및 총 패치 길이가 감소.
– 이러한 결과는 telomerase가 결핍된 마우스에서도 효과적인 stem cell competition을 위해 SSC가 Tert에 의존한다는 것을 나타내며, 따라서 stem cell competition에서 Tert의 필요성과 classical telomerase complex의 결합을 분리할 수 있음.
[Figure 2f] CreER의 활성화가 TetO 프로모터와 결합하여 활성화하는 tetracycline transactivator (tTA)의 발현시켜 transgenic Tert의 발현을 유도하면서 동시에 floxed Tert 유전자를 삭제하는 creER 마우스 모델 도입.
[Figure 2g-j] Tert 또는 Tertci transgenes의 발현은 패치 수, 평균 패치 길이 및 총 패치 길이를 완전히 회복시킴. 또한, Tertci를 발현하면 대조군인 TertCreER/+ 마우스에 비해 총 패치 길이가 유의하게 증가.
– 이러한 결과는 TERT가 catalytic activity와 무관하게 stem cell competition을 촉진한다는 것을 나타냄.
Differentiation of US cells lacking TERT
– TERT의 clonal deletion이 여러 시점에 걸쳐 SSC의 운명에 어떤 영향을 미치는지 조사
– TERT의 loss가 세포 증식에 어떤 영향을 미치는지 이해
Fig. 2: TERT는 telomerase complex 및 TERT catalytic activity와 무관하게 SSC 경쟁을 촉진.
k, 라벨링 후 7일 또는 14일 후의 tdTomato+GFRA1+ As 및 Apr 세포의 정량화.
l, tamoxifen 처리 후 6주째에 PLZF+ 세포를 포함하는 tdTomato+ 클론의 비율 정량화.
m, tamoxifen 처리 후 7일째 tdTomato+PLZF+ US에서 BrdU+ 세포의 정량화
[Figure 2k] tamoxifen 처리 14일 후, whole-mount immunofluorescence에 TertCreER/flox 마우스에서 tdTomato+ As와 Apr US가 현저히 감소하고 TERT 또는 TERTci에 의해 회복되는 것을 확인.
[Figure 2l] 6주 후, TertCreER/+ 및 TertCreER/flox 마우스에서 비슷한 빈도의 라벨링 패치가 발견되었을 때, 라벨링 클론에는 훨씬 적은 수의 PLZF+ US 세포가 포함되어 있음.
– 이러한 결과는 clonal TERT deletion이 US 세포의 DS committed progenitor cells로의 분화를 촉진한다는 것을 나타냄.
[Figure 2m] TertCreER/flox 마우스에서 BrdU를 발현하는 US 세포의 비율이 현저히 감소했으며, Tert 또는 Tertci의 transgenic expression으로 증식이 회복됨.
– 이러한 데이터를 종합하면, TERT-deleted SSCs에서 나타나는 impaired clone formation은 TERT의 loss가 분화 및 증식 감소를 촉진하기 때문에 발생한다는 것을 확인.
Reduced chromatin accessibility in US cells
– TERT deletion이 global chromatin structure에 미치는 영향
– clonal TERT deletion이 chromatin accessibility에 어떤 영향을 미치는지 이해
Fig. 3: TERT deletion은 SSC의 chromatin accessibility 및 MYC 경로를 손상시킴.
a, ATAC-seq 데이터의 Peak.
b, TSS 주변에서 읽은 ATAC-seq의 평균 태그 밀도.
c, TertCreER/+에서 US-h, US-m 및 DS 세포의 ATAC-seq 데이터와 TertCreER/flox 마우스의 PCA.
d, US-h, US-m 및 DS에서 TertCreER/+와 TertCreER/flox 간에 유의미한 차이가 있거나 SP 또는 RS에서 훨씬 더 개방적인 11,656개의 피크에 대한 Heat map.
e, TertCreER/+ 및 TertCreER/flox 마우스에서 US-h, US-m 및 DS 세포의 피크에 대한 벤 다이어그램.
[Figure 3a,b] transcription start sites (TSS)를 둘러싼 고유한 ATAC-seq 피크와 promoter chromatin accessibility 의 세포 수는 US-h와 US-m에서 가장 높았으며 DS와 SP로 분화하는 동안 크게 감소.
– US 세포 집단은 chromatin accessibility가 현저하게 증가하는 패턴을 보이며, lineage differentiation 중에 chromatin accessibility의 전반적인 감소가 발생한다는 것을 알 수 있습니다.
[Figure 3c] PCA를 통해 TERT를 deletion하면 differentiation axis를 따라 US-h와 US-m이 이동하는 반면, TERT의 loss는 committed DS에는 뚜렷한 영향을 미치지 않는 것으로 나타남.
[Figure 3a,b,d,e] purified populations of US에서 TERT를 deletion하면 개방형 open chromatin peaks의 수가 현저하게 감소하고 TSS를 둘러싼 chromatin accessibility가 대조군 DS와 유사한 수준으로 감소.
대조적으로, 피크 수는 DS에서 TERT deletion의 영향을 받지 않음.
– 이러한 데이터를 종합하면, TERT의 clonal inactivation은 stem-cell-containing population에서는 선택적으로 open chromatin의 loss를 유발하지만, committed progenitors에서는 그렇지 않다는 것을 보여주며, 이는 TERT deletion에 의한 stem cell differentiation 강화 모델과 일치.
Rescue of clone formation with MYC
– TERT가 SSC에서 competitive clone formation을 촉진하는 방법을 이해
– MYC를 과발현하면 TERT가 제거된 SSC에서 clonal formation의 실패를 복구할 수 있을 것이라는 가설
Fig. 3: TERT deletion은 SSC의 chromatin accessibility 및 MYC 경로를 손상시킴.
f, tdTomato+ US-h의 RNA-seq 데이터의 PCA.
g, TertCreER/flox US-h 세포에서 MYC target genes의 현저한 하향 조절.
h, 라벨링 후 7일째 testis 단면을 사용한 tdTomato+PLZF+ US에서 MYC 염색의 평균 신호 강도의 정량화
i, TertCreER/flox:Rosalsl-Tdtomato/lsl-tTA:TetO-hMYC mice.
j, 라벨링 3개월 후 untangled seminiferous tubules에서의 tdTomato에 대한 Epifluorescence.
k-m, 평균 패치 수(k), 평균 패치 길이(l) 및 총 패치 길이(m)의 정량화.
n, whole-mount immunofluorescence으로 검출한 라벨링 후 14일째의 tdTomato+GFRA1+ As 및 Apr 클론의 정량화.
o, 라벨링 후 7일째 testis 단면을 사용한 tdTomato+BrdU+PLZF+ US의 정량적 분석
[Figure 3f] PCA 결과, TERT-deleted US-h는 TERT+ 대조군과 별도로 클러스터 됨.
[Figure 3g] 가장 크게 하향 조절된 유전자 세트는 ‘MYC targets v.1’이었으며, 두 번째 유전자 세트인 ‘MYC targets v.2’로 나타남.
[Figure 3h] immunofluorescence analysis 결과, GSEA와 마찬가지로 TERT-deleted US에서 MYC protein levels이 유의하게 감소했으며, TERT 또는 TERTci의 transgenic expression에 의해 MYC 수치가 회복.
[Figure 3i] CreER을 activation시키면 Tert를 비활성화하고 tdTomato 라벨링. 또한 tTA를 발현시켜 transgenic MYC를 활성화하는 모델 도입.
[Figure 3j-m] tamoxifen 처리 3개월 후, 패치 수, 패치 길이 및 총 패치 길이를 측정한 결과 TERT loss 와 관련된 clone formation의 defects은 MYC 발현에 의해 상당히 회복됨.
[Figure 3n,o] MYC 발현은 또한 GFRA1+ 세포의 수와 TERT-deleted US의 증식을 회복.
– 이러한 결과를 종합하면, TERT는 MYC를 통해 stem cell competition을 촉진하고, TERT와 MYC 사이의 epistatic relationship을 확립한다는 것을 확인
Mild telomere shortening with TERT loss
– TERT를 잃은 클론을 불리하게 하여 stem cell competition을 촉진하는 TERT의 non-canonical effects가 tissue telomere lengths에 미치는 영향 확인
Fig. 4: TERT-dependent cell competition은 telomeres가 짧은 SSC를 제거.
a, tamoxifen 5mg 처리 1 년 후 tdTomato+ spermatocytes의 정량화
b, 라벨링 1 년 후 spermatocytes에서 telomere 신호의 정량화
c, SSC competition에서 TERT의 기능에 대한 요약 도식.
[Figure 4a] tamoxifen을 고용량으로 처리 1년 후, single cells의 immunofluorescence와 조직 절편의 immunohistochemistry를 통해 TERTCreER/+ 대조군에 비해 TERTCreER/flox 마우스에서 tdTomato+ 수컷 germ cells이 덜 풍부함을 확인.
[Figure 4b] TERTCreER/flox 마우스의 tdTomato+ spermatocytes에서 telomere 길이는 TERT의 loss로 인해 tdTomato- spermatocytes에 비해 12.7% 감소.
[Figure 4c] 이러한 발견은 stem cell competition을 강화하는 TERT의 non-canonical effects가 TERT가 loss되고 telomere가 약간만 단축된 세포를 도태시키는 역할을 할 수 있음을 보여줌.
– 이러한 관찰은 sperm과 early embryo에서 telomere가 유지되도록 하기 위해 telomere가 긴 세포를 선호하는 새로운 메커니즘을 제공.
Disscussion
Telomerase는 조직 줄기세포에서 telomere를 유지하는 데 필수적인 기능을 수행하지만, Telomerase loss 영향은 telomere가 점진적으로 짧아지는 장기간의 lag phase 이후에 분명해집니다. in vivo에서 개별 SSC의 운명을 추적한 결과, 우리는 SSC에서 TERT를 비활성화하면 rapid stem cell differentiation, chromatin accessibility의 global loss, MYC 발현 감소 및 clonal formation 장애가 촉진되며, 이러한 TERT가 제거된 줄기세포는 라벨이 없는 SSC와 경쟁하기 때문이라는 사실을 발견했습니다. stem cell competition을 촉진하는 TERT의 이러한 non-canonical effect는 촉매 기능과 무관하며, 매우 짧은 telomere로 인해 발생하는 노화와 위기의 근본적인 특징인 주목할 만한 lag phase 없이 발생합니다. 우리의 연구 결과는 TERT-deleted SSC에서 유래한 클론을 제거하는 것이 정자 집단에서 telomere가 약간만 단축된 세포를 도태시키는 수단을 나타내며, 따라서 가장 높은 TERT 수준을 가진 SSC에서 유래한 계통이 낮은 수준의 TERT를 가진 SSC에서 유래한 계통과 경쟁하기 때문에 정소에서 평생 동안 telomere 길이를 유지하는 역할을 할 수 있다는 모델을 제안합니다(그림 4c). telomere 기능 장애에 대한 체크포인트 반응은 매우 짧은 telomere를 가진 세포를 효과적으로 제거하지만, 여기서 확인된 non-canonical mechanisms은 telomere 기능 장애가 발생하기 훨씬 전에 약간의 telomere 단축만 있는 세포를 제거할 수 있는 수단을 제공합니다. 우리의 연구 결과는 TERT가 self-renewal을 선호하고 분화를 불리하게 함으로써 조직 줄기세포 간의 경쟁을 조절하는 핵심 결정 요인으로 자리매김했습니다. 이 결과는 마우스의 telomere가 충분히 긴 상태에서 germline에서 Tert의 비활성화가 잘 견뎌낸다는 점에서 주목할 만합니다. telomere가 긴 Telomerase 녹아웃 마우스에서 줄기세포 결함이 없는 것은 유전적 완충 또는 보상 또는 모든 세포에 TERT가 부족한 조직에서 경쟁이 부족하기 때문에 발생할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 germline gene inactivation은 한 층의 활동만 식별하는 반면, clonal, conditional gene deletion은 유전자 기능의 더 깊은 측면을 드러낼 수 있습니다.
TERT 수치는 줄기세포의 클론 확장에 중요하지만, pre-neoplastic processes와 carcinogenesis에서도 비슷한 역할을 할 수 있습니다. Germline TERT polymorphisms은 clonal haematopoiesis의 위험을 증가시키고 다양한 암 유형에 대한 감수성을 증가시킵니다. TERT 전사를 활성화하는 somatic TERT promoter mutations은 종양 진행 중에 강력한 positive selection을 보이는데, 이러한 돌연변이의 유병률이 pre-invasive 단계에서 invasive 단계로 갈수록 크게 증가하기 때문입니다. TERT-deleted SSCs에서 MYC 수치가 감소한다는 데이터는 이 모델을 뒷받침합니다. MYC 활성은 세포 경쟁의 결과를 결정하는 핵심 요소로, 높은 수준의 MYC를 발현하는 세포는 낮은 수준의 MYC를 발현하는 세포와 경쟁하며, MYC는 많은 인간 암에서 key node를 나타냅니다. 따라서 TERT의 상향 조절은 telomere 기능을 유지할 뿐만 아니라 MYC 경로를 활성화하여 암세포의 clonal expansion을 촉진할 수 있습니다. 이러한 데이터를 종합하면 in vivo 줄기세포에서 clonal competition을 촉진하는 데 있어 TERT의 non-canonical 역할을 확립하고 조직 항상성, 암 발생 및 telomere 유지에 대한 이해에 시사점을 제공합니다.