그림 6H와 6I에 요약된 우리의 결과는 p53이 필요한 endoreduplication를 통한 WGD의 경로를 설명한다. 이 경로는 oncogene 발현의 일반적인 결과인 replicative stress의 생성으로 시작된다. cyclin E 발현의 경우, replicative stress는 G1 단계 단축으로 인한 replication origin licensing system의 perturbation에서 발생한다(Macheret and Halazonetis, 2018; 17 Matson et al., 2017; 18 및 본 연구). 그러나 RasV12는 origin licensing을 감소시키지 않는다(그림 S3H). 대신 reactive oxygen species의 생성을 통해 replicative stress를 생성한다. 우리의 결과는 두 가지 유형의 스트레스가 mitotic bypass와 WGD를 유도할 수 있음을 보여준다. 게다가, aphidicolin 과 같은 replicative stress의 exogenous source는 mitotic bypass를 유도할 수 있다. 많은 항암제들이 DNA 복제를 방해함으로써 작용하기 때문에, 우리는 약물 치료가 화학 요법 후 암 진화에 영향을 미칠 수 있는 p53-proficient세포에서도 WGD를 촉진할 수 있다고 추측한다.

replicative stress는 장기간의 checkpoint-dependent G2 arrest 후 mitotic bypass를 유도하며, ATR은 DNA 손상 신호에 주로 책임이 있다. 이 mitotic bypass는 일반적으로 CDK 활성에 의해 억제되는 APC/C, APC/CCdh1의 G1 형태의 활성화를 필요로 한다. 인간 세포의 DNA damage checkpoint는 mitotic CDK의 Wee1 dependent inhibition을 통한 mitosis로의 진입을 차단한다. 이러한 CDK의 억제는 mitosis 진입을 방지하기에 충분하며 mitotic bypass에 필수적이지만 APC/CCdh1을 활성화하기에는 충분하지 않다. 대신, mitotic bypass는 추가적인 CDK inhibitor, p21을 필요로 하며, 이 경우, Wee1과 평행한 경로에서 p53을 통해 그 축적 또한 체크포인트 활성화에 의존한다. G2(높은 mVenus-Gem)에서 G1(낮은 mVenus-Gem)로 전환하는 데 걸리는 시간은 우리 실험에서 매우 다양했으며, 이는 APC/C의 스위치와 같은 활성화에 관련된 피드백 루프의 일부 또는 전부가 정상적인 세포 주기에서 anaphase 전환으로 완전히 작동하지 않음을 시사한다.

지속적인 cyclin E 발현 후 보이는 mitotic bypass는 aphidicolin에 의해 유도된 bypass와 유사한 속도를 가지며, cyclin E-CDK2의 진동이 endoreduplication에 필수적이지 않음을 나타낸다. 이것은 초파리에서 자연적으로 발생하는 endoreduplication 사이클과 대조되는데, 초파리는 origin licensing를 촉진하기 위해 낮은 cyclin E 기간을 필요로 하고 복제를 촉진하기 위해 높은 cyclin E 기간을 필요로 한다. 사람의 세포에서 cyclin E 발현이 직접적으로 라이센싱을 억제하지는 않는 것으로 보인다. 예를 들어, U2OS 셀에서 cyclin E의 과발현은 G1 단계 동안 MCM 로딩 속도에 영향을 미치지 않는다(그림 S2B 및 S2D). 더욱이, cyclin E는 Cdc6.37의 APC/C-dependent degradation을 방지함으로써 라이센싱에 긍정적인 역할을 한다. 이들 셀이 S phase에 진입할 때 나타나는 MCM 로딩 감소는 cyclin E 발현이 G1 phase를 단축시켜 라이센싱에 사용 가능한 시간을 단축시키기 때문이다(그림 S2B 및 S2C). 이러한 결과는 또한 cyclin E-CDK2 phosphorylation가 아닌 인간 cyclin A-CDK2가 시험관 내 APC/CCdh1 활성을 억제할 수 있다는 것을 보여주는 생화학 실험과 일치한다. 따라서, 우리의 결과는 cyclin E 과발현이 replication origin licensing이나 APC/CCdh1 활성을 직접적으로 억제하지 않는다는 생각과 일치한다.
aphidicolin에 의해 유도된 mitotic bypass 후, p53-proficient RPE1 세포는 노화와 같은 상태에서 정지한다. 이것은 G2에서 p53의 일시적인 유도가 mitotic bypass 후 노화 진입을 촉발한다는 것을 보여주는 이전 연구와 매우 관련이 있다. cyclin E 발현은 이러한 노화 진입을 방지하고 이러한 노화 세포가 endoreduplication을 완료하도록 할 수 있다. 예를 들어, CCNE1을 증폭함으로써, 노화에 들어가지 않고 endoreduplicate를 위해 준비되어야 한다. driver acquisition 전에 mitotic bypass및 노화가 발생하는 다른 경우, 후속 E2F deregulation 또는 p53 손실은 세포를 tetraploid 세포로서 노화로부터 다시 순환으로 몰아갈 수 있다.

이전 연구에 따르면 DSB는 p53이 부족한 세포에서 WGD를 구동할 수 있는 반면, 우리의 결과는 replicative stress에 의해 구동되는 WGD는 p53을 필요로 한다는 것을 보여준다. 두 경우 모두 WGD의 기본 메커니즘은 동일하며, 확장된 checkpoint-dependent CDK 불활성화는 APC/CCdh1 활성화 및 후속 mitotic bypass를 가능하게 한다. 그러나 DSB 구동 메커니즘은 DSB가 WGD를 방지하는 p53-dependent G1-arrest를 유발하기 때문에 p53 결핍을 필요로 한다. 여기서 우리가 replicative stress에 대해 설명하는 메커니즘은 p21로부터의 추가적인 CDK 억제가 mitotic bypass에 필수적이기 때문에 p53 숙련도를 필요로 한다; replicative stress가 p53-dependent G1-arrest를 유도하지 않기 때문에 p53 손실은 필요하지 않다. DSB 구동 메커니즘은 체크포인트 신호를 생성하기 위해 텔로미어 소모를 필요로 하며 p53 비활성화를 필요로 한다. 이러한 유전적 사건들은 모두 암에서 흔하며 따라서 두 경로 모두 암에서 중요한 역할을 할 수 있다.

우리의 결과는 viral oncogenes가 항상 p53을 완전히 비활성화시키지 않을 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들어, SV40 large T antigen에 의해 변형된 BJ 세포는 zeocin 또는 aphidicolin으로 처리될 때 여전히 p21을 발현할 수 있다(그림 5H). 또한 DSB 구동 및 replicative stress 구동 메커니즘 모두 p53 기능을 저하시킨 BJ-LT와 같은 세포에서 작동할 수 있다. 일반적인 p53 돌연변이의 능력을 DSB 유도와 replicative stress-driven endoreduplication 모두를 촉진하는 것은 흥미로울 것이다. p53은 고전적으로 tumor suppressor gene로 간주된다. 그러나 p53 null 돌연변이는 암에서 드물고, 암에서 p53 돌연변이의 분포에 대한 연구는 더 미묘한 시각을 가져왔다 우리의 결과는 p53의 이러한 관점에 들어맞고 p53이 replicative stress 중심의 WGD를 촉진함으로써 실제로 암 진화에 기여할 수 있음을 제안한다.