확장된 1000 Genomes project: 602개의 trio를 대상으로 High-coverage whole-genome sequencing 적용
![[EzV] The Smc56 complex is a DNA loop-extruding motor](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2023/04/EzV-The-Smc56-complex-is-a-DNA-loop-extruding-motor.png)
Abstract
세포 내 염색체의 정리를 위해서는 structural maintenance of chromosomes(SMC) 단백질 복합체의 구조적 유지가 필수적입니다. Cohesin과 condensin이 DNA 루프의 압출에 의해 염색체를 구성하는 반면, 진핵생물 SMC 복합체 중 3번째로 분류되는 Smc5/6의 분자 기능은 대부분 알려지지 않은 상태로 남아 있습니다.
이 논문에서는 Single-molecule imaging을 사용하여 Smc5/6이 extrusion에 의해 DNA loop를 형성한다는 것을 보여줍니다. ATP hydrolysis 시 Smc5/6은 DNA를 대칭적으로 회전시켜 초당 1kbp 쌍의 힘 의존적인 속도로 루프로 만듭니다. Smc5/6은 dimer의 형태로 루프를 압출하는 반면, monomer Smc5/6은 DNA를 따라 단일 방향으로 이동합니다. 또한, subunit인 Nse5와 Nse6(Nse5/6)가 loop extrusion의 negative regulator 역할을 한다는 것을 발견했습니다. Nse5/6은 Smc5/6 dimerization을 방해하여 loop extrusion 시작을 억제하지만, loop extrusion이 진행되는 중에는 영향을 주지 않습니다.
이들의 연구 결과는 분자 수준에서 Smc5/6의 기능을 밝히고 eukaryotic SMC 복합체 중 보존된 메커니즘으로 DNA loop extrusion을 설명합니다.
Figure
![[Fig1] The Smc56 complex is a DNA loop-extruding motor](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2023/04/Fig1-The-Smc56-complex-is-a-DNA-loop-extruding-motor.png)
[Figure 1] Smc5/6에 의한 loop extrusion의 실시간 이미징
a. S. cerevisiae Smc5/6 octameric 구조의 모식도입니다.
b. Wild Type Smc5/6 octameric complex의 ATPase 활성을 다양한 DNA concentration과 함께 보입니다.
c. WT, KE, EQ Smc5/6 complex의 ATPase 활성을 30nM plasmid DNA의 유무에 따라 보입니다.
d. DNA loop-extrusion assay의 모식도입니다.
e. Smc5/6 complex로 인한 DNA loop-extrusion 중간물들의 이미징 결과를 연속적으로 나열했습니다. (buffer flow 준 상태)
f. Buffer flow가 없는 상태에서 DNA 분자가 DNA loop extrusion을 거치는 것을 보이는 이미징 결과입니다.
g. Buffer flow가 없는 상태에서 DNA 분자가 DNA loop extrusion을 거치는 것을 보이는 fluorescence intensity kymograph(시간에 따른 DNA molecule fluorescence – looping 표현)입니다.
h. g 의 kymograph에서 표현된 영역들 별로 DNA 길이를 계산한 결과입니다.
i. 점진적인 DNA 수축 과정에 이어 발생한 loop-extrusion 발생에 대한 kymograph입니다.
j. 점진적인 DNA 수축 과정에 이어 발생한 loop-extrusion 발생에 대한 DNA 길이 계산입니다.
k. DNA loop 형성의 비율을 ATP 및 2nM Smc5/6의 유무에 따라 나타낸 차트입니다.
l. Smc5/6 loop extrusion showing rate의 Box-and-whisker plot입니다.
m. Smc5/6 loop extrusion stalling force의 Box-and-whisker plot입니다.
n. Two-/One-sided DNA reeling을 보인 loop-extrusion event의 비율입니다.
![[Fig2] The Smc56 complex is a DNA loop-extruding motor](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2023/04/Fig2-The-Smc56-complex-is-a-DNA-loop-extruding-motor.png)
[Figure 2] Smc5/6 complex의 dimer들이 DNA loop를 돌출시킨다
a, b, e. SxO-stained DNA(청색) 및 Alexa 647-labeled Smc5/6(빨간색)을 통해 loop extrusion 과정 중의 스냅샷을 촬영했습니다. (a: buffer flow 준 상태; b: buffer flow 없는 상태 + photobleaching event 1회; e: buffer flow 없는 상태 + photobleaching event 2회)
c, f. Loop extrusion event의 kymograph입니다. (c: b의 결과; f: e의 결과)
d, g: DNA 길이 및 Smc5/6 형광 농도의 시간에 따른 변화입니다. (d: c의 결과; g: f의 결과)
h. Loop-extrusion event의 fluorescence intensity 발생에 대한 확률밀도분포(Probability density function; PDF)를 보입니다. Alexa 647 signal의 label이 없는 경우 및 bleaching 횟수에 따라 정리했습니다.
i. 거쳤던 bleaching 과정에 따라 나눈 뒤 각각의 Loop-extruding Smc5/6 event 비율을 보입니다.
j. 각기 다른 bleaching step에 따라 Nse2-labelled Smc5/6의 비율을 보입니다. (labeling efficiency 70%)
k. 명시된 Smc5/6 concentration에 따라 loop-extrusion event가 발생한 비율을 나타냅니다.
l. Smc5/6 concentration에 따라 loop을 형성한 DNA substrates의 비율을 보여주는 Langmuir-Hill plot입니다.
![[Fig3] The Smc56 complex is a DNA loop-extruding motor](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2023/04/Fig3-The-Smc56-complex-is-a-DNA-loop-extruding-motor.png)
[Figure 3] 단일 Smc5/6 complex들이 DNA 상에서 특정 방향 없이 옮겨 다닌다
a. labelled Smc5/6 complex가 DNA 분자 위에서 옮겨 다니는 현상에 대한 snapshot(왼쪽) 및 kymograph(오른쪽)을 보입니다.
b. 개별 Smc5/6 nonlooping event의 kymograph trajectory에서 만든 MSD plot입니다.
c. DNA에서 분리되기 전 움직이지 않거나, 특정 방향을 통해 움직이거나, 특정 방향 없이 움직인 nonlooping Smc5/6 complex의 비율입니다.
d. bleaching step을 1회(초록), 2회(주황) 혹은 그 이상 거친 nonlooping Smc5/6 complex의 비율입니다.
e, f. Smc5/6 및 DNA의 스냅샷 및 kymograph입니다. (e) Smc5/6 label intensity의 시간에 따른 변화를 보입니다. (f) translocating Smc5/6이 또다른 Smc5/6과 dimer를 형성하여 DNA loop extrusion을 시작하는 과정을 포함합니다.
![[Fig4] The Smc56 complex is a DNA loop-extruding motor](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2023/04/Fig4-The-Smc56-complex-is-a-DNA-loop-extruding-motor.png)
[Figure 4] Nse5/6은 Smc5/6 dimerization을 방해하며 loop extrusion을 억제한다
a. Octameric(+Nse5/6), hexameric(-Nse5/6) 혹은 pentaberic(-Nse2/5/6) complex를 추가함에 따라 DNA molecule이 루프를 형성하는 비율을 나타냅니다.
b. octameric & hexameric complex의 loop-extrusion rate입니다.
c. octameric & hexameric complex의 loop dwell time입니다.
d. Label이 없거나, Nse4-labelled hexamer 및 Nse5-labelled octamers에 대해 1,2,>2회 bleaching step을 거친 loop-extruding complex의 비율입니다.
e. Octamer 및 hexamer의 DNA binding 당 looping event 및 translocating 비율입니다.
f. Ocatmer, hexamer, hexamer + Nse5/6(1:1비율)의 경우에 따른 질량 분포를 나타냅니다. ATP 없는 DNA 존재 하에 측정되었습니다.
g. Mass photometry를 통해 측정된, WT 및 EQ mutant Smc5/6의 monomer, dimer, trimer의 Smc5/6 비율입니다.
h. 돌출된 loop(청색) 및 이를 발생시킨 hexamer(빨간색)의 스냅샷입니다. High-salt buffer flow 환경에서 촬영되었습니다.
i. Nonlooping Smc5/6의 high-salt buffer flow 환경에서의 스냅샷입니다.
j. i에서의 high-salt wash 과정 중 Nse2-labelled octamer의 시간에 따른 fluorescence 정도를 보입니다.
k. high-salt wash 이후에도 DNA 상에 붙어 있는 labelled octamer 및 hexamer의 비율입니다.
l. Smc5/6-mediated loop extrusion의 모델을 제시합니다.