ZBP1에 의한 Telomere-to-mitochondria 신호는 복제 위기를 중재합니다
Abstract
암은 세포가 텔로미어 기반 증식 장벽을 회피하고 불멸을 달성할 수 있게 하는 유전적 및 후성적 변화의 축적을 통해 발생합니다. 그러한 장벽 중 하나는 불안정한 텔로미어 및 기타 암 관련 염색체 이상을 가진 체크포인트 결핍 세포를 제거하는 자가포식 의존 프로그램인 복제 위기입니다. 그러나 이 중요한 종양 억제 장벽의 시작을 조절하는 분자적 사건에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
이 연구에서는 타고난 면역 센서 Z-DNA 결합 단백질 1 (ZBP1)을 위기 프로그램의 조절자로 확인했습니다. ZBP1의 위기 관련 isoform은 cGAS-STING DNA 감지 경로에 의해 유도되지만 기능 장애 텔로미어에서 합성된 TERRA (텔로미어 반복 포함 RNA) 전사와 관련될 때만 완전한 활성화에 도달합니다. TERRA에 결합된 ZBP1은 미토콘드리아 하위 집합의 외부 미토콘드리아 막에서 필라멘트로 올리고머화 되어 선천적 면역 어댑터 단백질인 미토콘드리아 항바이러스 신호 단백질 (MAVS)을 활성화합니다. 우리는 ZBP1의 이러한 올리고머화 특성이 해로운 MAVS 의존 인터페론 반응을 시작하기에 충분한 TERRA-ZBP1 상호작용이 거의 없는 신호 증폭 메커니즘으로 작용한다고 제안합니다.
우리의 연구는 텔로미어 매개 종양 억제 메커니즘을 밝혀내어 기능 장애가 있는 텔로미어가 미토콘드리아 TERRA-ZBP1 복합체를 통해 선천적 면역 반응을 활성화하여 신생 형질 전환을 위한 세포를 제거합니다.
Figure
[Figure 1] ZBP1은 위기 동안 타고난 면역 반응을 중재합니다
(A) 위기 이전 IMR90E6E7 섬유아세포를 Brunello 라이브러리로 형질도입하고, 게놈 DNA를 0일과 15일에 수집 후, gRNA 변화를 측정한 결과.
(B) ZBP1 (siZBP1) 또는 대조군 (siCtrl)에 대한 2개의 개별 siRNA로 형질감염된 성장 (PD61), 위기 (PD105) 및 위기 이전 (PD100) IMR90E6E7 섬유아세포의 ISG의 RNA-seq 분석
(C) WT ZBP1(S)-Flag 또는 ZBP1(S)-Flag로 재구성된 위기 전 (PD94) ZBP1-knock out IMR90E6E7 섬유아세포의 대표적인 IncuCyte 이미지와 분석.
(D) ISG의 RT-qPCR 분석.
[Figure 2] ZBP1 의존 IFN 신호 전달에는 텔로미어 기능 장애가 필요합니다
(A) TRF2 (shTRF2)에 대한 비표적화 대조군 shRNA 또는 shRNA를 발현하는 성장하는 (PD35) IMR90E6E7 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석.
(B) TRF2에 대한 비표적 대조군 shRNA 또는 shRNA를 발현하는 성장하는 (PD35) IMR90E6E7 섬유아세포에서 ISG의 RT-qPCR 분석.
(C) 표시된 PD에서 빈 벡터 또는 hTERT를 발현하는 IMR90E6E7 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석.
(D) ZBP1 (L) 또는 ZBP1 (S)를 발현하는 성장 (PD42), 위기 전 (PD100) 및 텔로머라제 양성 (PD105) IMR90E6E7 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석.
[Figure 3] ZBP1은 TERRA를 감지합니다
(A-B) TERRA 성적표의 RT-qPCR 분석.
(C) 서브텔로미어-텔로미어 경계의 10kb 업스트림 내 ZBP1 관련 RNA 전사체의 fRIP-seq 농축.
(D) TERRA 전사체를 표적으로 하는 32P-dCTP-표지 프로브를 사용한 anti-Flag immunoprecipitate (fRIP) 또는 총 용해물 (Input)로부터의 RNA-dot blot.
(E) TRF1 (ΔN) 또는 VP16-TRF1 (ΔN)을 사용하여 성장하는 (PD35) IMR90E6E7 섬유아세포(WT ZBP1(S)-Flag 또는 Zα2가 없는 ZBP1(S)-Flag)의 웨스턴 블롯 분석.
(F) 배양 24시간 후 50일째의 IncuCyte 이미지와 분석.
(G) ISG RNA 히트맵.
[Figure 4] ZBP1 종속 신호는 MAVS에 의해 중재됩니다
(A) 성장 및 위기 IMR90E6E7 및 WI38SV40LT 섬유아세포, 위기 IMR90E6E7 및 WI38SV40LT 섬유아세포 발현 WT ZBP1(S)–Flag 또는 ZBP1(S)–Flag 포함 Zα2, RHIM1 또는 RHIM2, 내인성 ZBP1 또는 Flag에 대해 Immunostaining 이미지와 분석.
(B) 빈 벡터, WT ZBP1(S)-Flag 또는 도메인 점 돌연변이를 포함하는 ZBP1(S)-Flag를 발현하는 성장 및 위기 이전 IMR90E6E7 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석.
(C) 성장 및 위기 이전 IMR90E6E7 섬유아세포에서 ISG의 RT-qPCR 분석.
(D) Flag 및 MAVS에 대해 immunostaining된 Flag-ZBP1(S) 또는 Flag-ZBP1(S)-FIS1을 발현하는 성장하는 IMR90E6E7 섬유아세포.
(E) ISG의 RT–qPCR 분석.
(F) e에 기재된 성장 IMR90E6E7 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석.
(G) 성장하는 (PD66) IMR90E6E7 섬유아세포에서 ISG의 RT-qPCR 분석.