RNA 표적화는 CRISPR-Cas12a2의 무차별적인 핵산분해효소 활성을 가능하게 한다
![[EzV] RNA targeting unleashes indiscriminate nuclease activity of CRISPR–Cas12a2](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2023/01/EzV-RNA-targeting-unleashes-indiscriminate-nuclease-activity-of-CRISPR%E2%80%93Cas12a2.png)
Abstract
Cas12a2는 상보적인 RNA 표적의 인식에 따라 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA 및 이중 가닥 DNA의 RNA 유도 비특이적 분해를 수행하여 불발 감염(abortive infection)을 최종 반응으로 하는 CRISPR 관련 핵산 분해 효소입니다.
이 논문에서는 완전한 활성화 경로를 밝히기 위해 이진, 삼원 및 사원 복합체의 Cas12a2 구조를 보고합니다. 연구진들이 보고하는 해당 구조는 Cas12a2가 동족 RNA 표적에 결합할 때까지 자동으로 억제된다는 것을 보여주는데, 이는 RuvC 활성 부위를 크고 양전하를 띤 균열 내에 노출시킵니다. 이중 가닥 DNA 기질은 이중 가닥 DNA 분해 및 생체 내 면역계의 기능에 중요한 ‘aromatic clamp’ 잔기 쌍에 의해 안정화된 이중 가닥 DNA 변형 및 local melting을 통해 포착됩니다.
이들의 연구는 인구 수준의 면역을 달성하기 위해 이러한 낙태 감염 메커니즘에 대한 구조적 근거를 제공하며, 이를 활용하여 다양한 부수 기질을 분해하는 합리적인 돌연변이를 생성할 수 있습니다.
Figure
![[Fig1] RNA targeting unleashes indiscriminate nuclease activity of CRISPR–Cas12a2](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2023/01/Fig1-RNA-targeting-unleashes-indiscriminate-nuclease-activity-of-CRISPR%E2%80%93Cas12a2.png)
[Figure 1] Cas12a2 binary complex는 굴과 닮아 있으며 crRNA가 정렬되어 있다
(a) Cas12a2의 도메인 정렬 구조입니다.
(b) Cas12a2의 binary complex입니다. (a)의 도메인 구조에 따라 색칠되었습니다.
(c) Cas12a2의 binary complex의 원자 모형입니다.
(d) crRNA seed region의 추정 형태입니다. 3’ end에서의 7개의 염기서열이 정렬되어 있으며, 바깥으로 노출되어 있습니다. Target RNA 결합 지점으로서의 역할을 할 것으로 추정됩니다.
![[Fig2] RNA targeting unleashes indiscriminate nuclease activity of CRISPR–Cas12a2](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2023/01/Fig2-RNA-targeting-unleashes-indiscriminate-nuclease-activity-of-CRISPR%E2%80%93Cas12a2.png)
[Figure 2] Target binding은 활성화를 위한 대규모 구조적 배열로 이어진다
(a) crRNA-TS duplex의 모식도입니다.
(b) Cas12a2 ternary complex의 Cryo-EM 구조입니다.
(c) Cas12a2 ternary complex의 원자 모델입니다.
(d) Ternary complex 형성에 따라 유도된 Cas12a2의 형태 변화를 보여주는 motion vector map입니다.
(e) binary 및 ternary complex의 표면 정전 전위입니다. Ternary complex 형성 후 활성 부위(점선 원)가 어떻게 노출되는지 보여줍니다.
(f) RuvC gating helix(빨강)가 제자리에서 약 8 Å만큼 움직입니다. 이후의 ternary complex는 활성 부위를 노출하는 구조가 됩니다.
(g) SYBR 염색에 의해 드러난 표적 보호 작용의 정도입니다. Binary complex가 몰 초과 상태일 때 표적 RNA의 말초 절단을 의미하고, 표적이 몰 초과일 때는 총 분해를 의미합니다.
![[Fig3] RNA targeting unleashes indiscriminate nuclease activity of CRISPR–Cas12a2](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2023/01/Fig3-RNA-targeting-unleashes-indiscriminate-nuclease-activity-of-CRISPR%E2%80%93Cas12a2.png)
[Figure 3] Cas12a2는 duplex DNA과 결합하며 고정시킨다
(a) Cas12a2 quatenary complex의 Cryo-EM 구조입니다.
(b) Cas12a2 quatenary complex의 원자 모델입니다.
(c) dsDNA가 활성 영역에 자리잡은 상황입니다.
(d) Cas12a2 활성 영역의 근접 모식도입니다.
(e) aromatic clamp를 통해 제자리에 고정된 CS입니다.
(f) aromatic clamp를 통해 제자리에 고정된 NCS입니다.
(g) Cas12a2 및 나란히 있는 dsDNA 기질 간의 상호 작용에 대한 모식도입니다.
(h) ssRNA(위), ssDNA(중간), 그리고 dsDNA(아래)가 Cas12a2 및 aromatic clump의 변이체에 의해 잘린 결과입니다.
(i) 필수 잔류물들이 변형됨으로 인해 플라스미드를 제거하는 Cas12a2의 능력이 상실되었습니다.
![[Fig4] RNA targeting unleashes indiscriminate nuclease activity of CRISPR–Cas12a2](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2023/01/Fig4-RNA-targeting-unleashes-indiscriminate-nuclease-activity-of-CRISPR%E2%80%93Cas12a2.png)
[Figure 4] Cas12a2에서 RNA 표적 활성화 핵산분해효소의 활성 메커니즘
Duplex complex(Cas12a2–crRNA)에서 활성 부위는 가려집니다. crRNA의 3′ 말단은 미리 정렬된 seed이며, PI 도메인은 유동적입니다. PFS를 포함하는 상보적 RNA 표적 가닥(TS)의 결합은 REC lobe 내에서 상당한 형태 변화를 촉발하여 cis에서 TS RNA trimming과 trans에서 nuclease activity를 촉진하기 위해 RuvC 활성 부위를 노출시킵니다. 이는 trans에서 dsDNA의 결합을 가능하게 하여 duplex kinking 및 local melting을 초래한다. Duplex는 두 쌍의 방향족 clamp 잔류물(그림 3)의 작용을 통해 개방되어 RuvC에 의한 nicking이 가능합니다.
Disscussion
해당 연구 결과는 antiphage 방어에서 Cas12a2의 세부 메커니즘을 제시합니다. crRNA를 PFS-함유 RNA 표적에 대한 하이브리드화는 Cas12a2의 주요 형태 변화를 유도하여 RuvC 활성 부위를 노출시키고 자동 억제를 완화시킵니다(Figure 4). 활성 복합체에서, RuvC 도메인은 이중화된 핵산을 수용하기에 충분히 큰 약 30Å 폭의 양전하를 띤 홈 내에 위치합니다. 비특이적인 정전기 상호작용은 이중 왜곡과 국소 염기쌍 용융을 동반하여 부수적인 기질 포착을 용이하게 합니다. 녹은 염기는 RuvC 활성 부위 내에서 단일 핵산 가닥의 적절한 위치를 가능하게 하는 두 쌍의 방향족 클램프에 의해 안정화됩니다. 이러한 다중 전환 DNA 절단은 Cas12a 또는 Cas9의 단일 전환 dsDNA 절단과는 구별되는 dsDNA 분해로 절정에 이르며, 생체 내에서 강력하고 광범위한 DNA 파괴를 가능하게 합니다.
Cas12a와 Cas12a2는 유사한 WED 도메인과 RuvC 도메인으로 인해 동일한 crRNA를 사용할 수 있지만, 여러 구조적 차이는 상이한 표적 선호도와 생화학적 활성을 부여하고, Cas12a2가 다수의 Cas12a 표적 항CRISPR 단백질에 의한 억제를 피할 수 있게 합니다. 특히, Nuc 도메인(target loading domain 또는 target nucleic acid binding domain이라고도 함)의 결핍은 Cas12a2가 R-loop의 형성을 통해 dsDNA 표적을 직접 결합하지 못하는 것에 기여할 수 있으며, ssRNA 표적 결합에 대한 특이성을 제공합니다. 또한, Cas12a2 Nuc 도메인의 부족은 RuvC 핵산 분해 효소 활성 부위에 대한 접근성을 증가시켜 트랜스에서 빠른 이중 포획 및 절단을 가능하게 합니다. bystander ssDNA에 결합된 Cas12b 및 Cas12i의 이전 구조는 trans ssDNA 기질이 견고한 dsDNA 기질과 호환되지 않는 RuvC 활성 부위에 도달하기 위해 꼬불꼬불하고 좁은 경로를 따라야 한다는 것을 보여주었습니다. 이는 고도로 노출된 Cas12a2 RuvC 활성 부위와 대조적으로 트랜스에서 dsDNA 절단을 위한 구조적 메커니즘을 제공합니다.
Cas12a2의 메커니즘은 Cas13에 의한 RNA 표적화를 연상시키지만, 몇 가지 뚜렷한 차이점이 있습니다. Cas13에 의한 표적 결합은 시스 및 트랜스 모두에서 비특이적 RNA 분해를 활성화하여, 파지 게놈이 표적 전사체를 계속 생성함에 따라 지속적인 핵산 분해 효소 활성화를 초래합니다. RNA 절단은 표적이 crRNA와 완전히 교배하여 종자 영역의 반대쪽 원위 활성 부위에 도달하기에 적합한 길이인 경우 시스에서 발생할 수 있습니다. 마찬가지로, Cas12a2는 cis에서 표적 RNA를 trimming할 수 있지만, 하이브리드화된 표적 가닥은 그대로 남아 있어 중단되지 않은 Cas12a2 활성화를 가능하게 합니다. 따라서 Cas13 시스템은 바이러스 RNA의 보초 역할을 하는 반면, Cas12a2는 자가 파괴 버튼을 나타내어 낙태 감염을 통해 모집단 수준의 antiphage 방어를 제공합니다. Cas12a2 활성화의 결과는 다른 방어 시스템(예: 제한-수정 시스템 및 DNA 대상 CRISPR-Cas 시스템)에 의한 파지 전사 인코딩 DNA의 제거와 결합된 단백질 분해 및 회전을 통해 완화될 수 있습니다.
DNA를 절단할 수 있지만 dsDNA 또는 ssRNA가 아닌 Cas12a2(Y1069A) 포인트 돌연변이를 이번 연구에서 발견했는데, 이는 샘플에서 다른 RNA의 과잉을 감지하거나 주의를 산만하게 하도록 설계된 RNA 표적을 파괴하지 않는 부수적인 활동을 가진 RNA 센서에 대한 청사진을 제공하며, 이는 매우 민감한 진단용 RNA의 개발을 가능하게 할 수 있습니다.