Glucose DDX21 dimer를 분해하여 mRNA splicing과 tissue differentiation를 조절.
Abstract
Glucose는 보편적인 생물 에너지 공급원이지만, 단백질 상호 작용을 제어하는 데 있어서 glucose의 역할은 differentiation-associated intracellular glucose 상승 동안의 작용과 마찬가지로 인정되지 않는다. Azido-glucose click chemistry는 epidermal differentiation에 필수적인 것으로 밝혀진 DDX21 RNA helicase를 포함한 다양한 RNA binding protein (RBP)에 대한 glucose 결합을 확인하였다. glucose은 DDX21의 ATP-binding domain에 결합하여 protein conformation을 변화시키고, helicase 활성을 억제하며, DDX21 dimer를 해리시킨다. 분화 중 glucose 상승은 DDX21이 RNA splicing factor를 포함하는 더 큰 단백질 복합체로 조립된 nucleolus에서 nucleoplasm로의 DDX21 re-localization과 관련이 있었다. DDX21은 glucose-dependent 방식으로 mRNA intron에서 특정 SCUGSDGC 모티프에 국한되었으며 GRHL3, KLF4, OVOL1, RBPJ를 포함한 주요 pro-differentiation gene의 접합을 촉진했다. 이러한 발견은 조직 분화에 필수적인 RNA helicase의 dimerization 및 기능을 조절하는 glucose에 대한 생화학적 작용 메커니즘을 밝혀낸다.
Figure
Figure 1. Glucose는 DDX21에 결합하고, DDX21은 epidermal differentiation에 필수적이다.
(A) MS가 dextran column (왼쪽) 또는 azido glucose (오른쪽)를 사용하여 glucose binding protein을 발견하기 위한 워크플로우.
(B) 91개의 일반적으로 농축된 단백질 중 최상위 농축 단백질의 Heatmap.
(C) dextran column에 있는 최상위 농축 helicases의 Heatmap.
(D) DDX21 shRNA와 대조군 shRNA를 비교하는 skin tissue organoid의 Keratin 1(K1), Keratin 10(K10), DDX21 및 Collagen VII(Col7) staining.
(E) 분화된 세포와 skin tissue organoid (RNA-seq)의 DDX21 loss에 따른 progenitor and differentiation marker의 변화.
(F 및 G) 분화된 세포(F)와 organotypic human epidermal tissue (G)의 RNA-seq 안의 두 shDDX21 사이의 downregulated gene의 중첩을 보여주는 벤다이어그램(FDR < 0.05).
(H) organotypic human epidermal tissue의 RNA-seq에서 downregulated된 RNA에 대한 생물학적 프로세스 GO term의 조정된 p 값(G의 178개 유전자).
Figure 2. Glucose는 DDX21의 ATP binding site에 결합하고 DDX21 protein conformation를 변화시킨다.
(A) glucose ±1 mM ATP에 대한 DDX21의 binding affinity의 MST.
(B) ATP ±350 μM glucose 또는 galactose에 결합하는 DDX21의 MST.
(C) DDX21WT, K236R 및 K236G 돌연변이에 대한 glucose 결합의 MST.
(D) DDX21WT, K236R 및 K236G 돌연변이의 ATP-binding affinity의 MST.
(E) DDX21 ± galactose 또는 ±glucose의 Helicase activity.
(F) UCSF Chimera에 의한 molecular docking은 DDX21에 대한 glucose의 예상 binding site를 보여준다(PDB: 6L5N).
(G) glucose modification이 없는 peptides의 Relative abundance는 350 μM glucose/ no- glucose에서 얻은 강도로 계산되며, 둘 다 UVC crosslinking를 가지고 있다(가장 풍부한 펩타이드 상위 15개).
(H) UVC crosslinking 중 glucose incubation (빨강)이 있거나 없는(검은색) DDX21(ELANQVSK) 표적 펩타이드의 Selected ion chromatography (SIC)와 MS.
(I) DDX21WT 및 V276W 돌연변이에 대한 glucose 결합의 MST 분석.
(J 및 K) BS3-induced protein site는 PBS, 1 mM ATP 또는 350 μM glucose에서 crosslinked되어 있다.
Figure 3. Glucose는 DDX21의 dimerization를 억제하고 DDX21을 nucleoplasm에 re-localize한다.
(A) DDX21 dimerization ±350 μM glucose 또는 galactose의 MST.
(B) DDX21 돌연변이가 DDX21 dimerization에 미치는 영향의 MST.
(C) blue native gel의 HA western blot 분석에서 얻은 DDX21 ±350 μM glucose 또는 galactose의 dimer/monomer 비율.
(D) progenitor과 낮은 glucose 또는 정상 glucose에서 유지되는 differentiated cell에서 FHH-DDX21과 V5-DDX21(dimerization) 사이의 상호작용에 대한 PLA 신호.
(E) ATP ±350μM glucose에 결합하는 dimerization mutant DDX21611R의 MST.
(F) HEK293T 또는 keratinocyte progenitor에서 nucleoplasm에 국한된 DDX21WT 또는 dimerization mutant를 가진 세포의 백분율.
(G) HEK293T 세포에서 HA-DDX21 WT 및 dimerization mutant의 Immunofluorescence.
(H) keratinocyte progenitor와 정상 또는 낮은 glucose에서 성장한 differentiated cell에서 HA-DDX21의 Immunofluorescence.
(I) progenitor와 정상 또는 낮은 glucose에서 성장한 differentiated cell에서 nucleolus fractionation의 Western blot.
(J) Western blot에서 나온 nucleoplasm (Np)/nucleolus (No)의 상대적인 FHH-DDX21 abundance.
(K) 세 가지 조건에서 nucleoplasmic FHH-DDX21을 가진 세포의 백분율: progenitor keratinocytes, differentiated cells grown in low or normal glucose.
Figure 4. DDX21-enabled differentiation은 ATPase-independent이며 glucose binding이 필요하다.
(A) 13C6 glucose와 2H4 ATP(상단 2열) 또는 가벼운 glucose과 ATP(하단 2열)로 배양된 progenitor와 differentiated keratinocyte의 13C와 2H의 NanoSIMS.
(B) progenitor and differentiated cell에서 2H와 13C에 대한 총 탄소수(12C+13C)로 정규화된 Relative count.
(C) organotypic human epidermal tissue의 Keratin 1(K1, 적색)과 Keratin 10(K10, 녹색) staining후 DDX21 shRNA비교,
(D) organotypic human epidermal tissue에서 WT 또는 돌연변이 DDX21 rescue를 가진 대조군 shRNA, DDX21 shRNA, DDX21 shRNA에서 progenitor and differentiation marker의 qPCR.
(E) organotypic human epidermal tissue으로 성장한 K236R, K236G 및 611R 돌연변이가 있는 endogenous DDX21 gene locus에서 gene editing 후 primary keratinocyte의 progenitor and differentiation marker의 qPCR.
Figure 5. Glucose는 DDX21을 RNA splicing factor를 포함하는 더 큰 복합체로 전환한다.
(A) 고분자량(HMW) 분획에서 13.75-19mL ±350μM glucose 인큐베이션의 FPLC에서 HA-DDX21 및 HNRNPC의 Western blot.
(B) Western blot의 HMW 분획에서 ±350 μM glucose에서 FPLC에서 DDX21 단백질의 분포.
(C) BioID hits에서 정상 또는 낮은 glucose로 유지되는 progenitor, differentiated cell에서 풍부한 유전자의 Overlap.
(D) DDX21 proximal proteome의 단백질에서 Cell components enrichment.
(E) 472개의 total enriched gene 중 분화된 세포에서 정상 또는 낮은 glucose로부터 LC-MS/MS를 통해 얻은 DDX21/GFP enrichment ratio 간의 상관관계.
(F 및 G) 정상 glucose (F) 또는 낮은 glucose 과 비교하여 정상 glucose(G) 과 비교하여 낮은 glucose에서 DDX21 proximal proteome이 top biological process GO term의 조정된 p 값.
(H) 정상 또는 낮은 glucose에서 성장한 differentiated cell, progenitor에서 HA-DDX21 immunoprecipitation 후 HNRNPUL1의 Western blot.
(I) western blot의 낮은 glucose과 비교하여 정상 glucose에서 HNRNPUL1의 Relative enrichment.
(J) western blot으로부터 정상 또는 낮은 glucose에서 성장한 differentiated cell에서 HMW 분획에서 13.75-17.25mL의 DDX21 FPLC 분포.
Figure 6, Glucose는 DDX21이 RNA intron에 결합하는 것을 조절한다.
(A) 정상 glucose에서 성장한 differentiated keratinocyte에서 DDX21 CLIP-seq 피크의 HOMER de novo 검색으로 확인된 모티프.
(B) SCUGSDGC(D: A, G 또는 U; S: C 또는 G) 모티프 RNA(“CLIP RNA”), G4 RNA 또는 무작위 RNA 서열에 결합하는 DDX21의 MST 분석.
(C) easyCLIP-seq에서 정상 또는 낮은 glucose에서 성장한 progenitor, differentiated cell에서 DDX21에 결합하는 표시된 RNA의 백분율.
(D) 정상 또는 낮은 glucose에서 성장한 progenitor cells, differentiated cell의 RNA 인트론에서 읽은 DDX21 CLIP-seq의 백분율
(E) 정상(흑색) 또는 낮은(적색) glucose에서 성장한 differentiated keratinocyte에서 JUP 및 GRHL3 RNA에 대한 DDX21의 결합.
(F) progenitor과 정상 또는 낮은 glucose에서 differentiated cell에서 지시된 RNA에 DDX21의 결합.
(G) easyCLIP-seq에 의한 HEK293T 세포의 DDX21 WT 및 돌연변이체에 대한 표시된 RNA 결합의 백분율.
(H) HEK293T 세포에서 표시된 RNA에 대한 DDX21 WT 및 돌연변이의 결합.
Disscussion
여기서 우리는 glucose가 다양한 RBP에 직접 결합하고, mammalian tissue differentiation에서 DDX21에 필수적인 역할을 하는 DDX21 DEAD-box RNA helicase의 위치와 기능을 구체적으로 제어한다는 것을 보여준다. 이 설정에서 glucose 상승은 DDX21 작용을 제어하기 위한 differentiation-induced cue로 작용한다. DDX21은 helicase-independent fashion으로 epidermal tissue differentiation에 필수적인 것으로 밝혀졌으며, 직접 glucose 결합은 ATP와 경쟁하여 DDX21 단백질의 conformational change를 유도하고 dimer를 해리시켰다. DDX21 monomer는 nucleolus에서 nucleoplasm로 re-localized되어 RNA splicing factor를 가진 더 큰 분자량 복합체로 조립되었다. 분화 동안, 그리고 glucose-dependent manner로 DDX21은 differentially skipped mRNA exon의 접합에서 풍부한 RNA 모티프와의 증가된 연관성을 동반하여 nucleolar RNA와의 연관성이 감소했다. 마지막으로, DDX21은 helicase 활성과 무관한 중요한 pro-differentiation 유전자의 splicing에 영향을 미쳤다. 여기서 mRNA splicing에서 DDX21을 암시하는 연구 결과는 SMN2에 대한 최근 연구에 의해 뒷받침된다. 이 데이터들을 종합하면, epidermal differentiation에서 DDX21을 조절하는 biomolecular cue로서의 glucose 작용 메커니즘을 밝혀낸다.
epidermal differentiation 동안, 일반적인 translation의 감소가 관찰되며, 이는 에너지 및 영양소 지출을 감소시켜 분화에 걸친 세포 glucose 농도 증가에 대한 비에너지적인 역할을 시사한다. 이전 연구는 조직 항상성에서 glucose의 역할을 지원한다. 예를 들어, glucose의 증가는 체세포의 증식을 늦추고 DNA와 단백질 합성을 억제한다. 피부에서 증가된 glucose 농도에 장기간 노출되면 사람의 epidermal keratinocyte의 replicative life가 감소하는 반면, glucose은 사람의 epidermal tissue의 differentiating cell에 축적된다. 임상적으로 조직 glucose 수치 상승을 특징으로 하는 당뇨병은 조직 glucose 증가와 체내 혈관 공급의 상대적 기여가 아직 해부되지 않았지만 epidermal regeneration 및 상처 치유가 좋지 않은 것과 관련이 있다. 한편, epidermal differentiation에서 필수적인 glucose 기능은 glucose가 단백질 기능의 molecular modulator로 작용하여 조직 항상성에서 glucose의 역할을 지원하는 것으로 확인되었다. 이와 관련하여, 대사적으로 안정한 glucose analogs는 glucose 제한을 쉽게 해소하고, glucose 자체를 유리시키기 위해 glucose에 유사한 영향을 미친다.
Dimerization 조절은 transcription factor에서 signaling protein, 효소에 이르기까지 다양한 단백질의 기능을 제어하기 위해 현재 관찰되는 생물학적 메커니즘이다. 특히, RBP의 dimerization은 RNA binding affinity 및 enzymatic activity를 증가시키는 것으로 보고되었다. 반면, de-dimerized RBP는 뚜렷한 기능과 위치를 가질 수 있다. 예를 들어, polypyrimidine tract-binding protein (PTB)은 핵에서 dimeric, 세포질에서 monomeric이며, 세포질의 PTB monomer는 리보솜과 결합하여 p53의 translation을 향상시킨다. 이와 관련하여, 여기서 확인된 91개의 glucose binding protein 중 29개가 RBP이며, 상위 히트 중에는 DDX21, SF3A1, G3BP1, IGF2BP3, CCT5가 포함되어 있어 glucose 가 RBP 기능의 광범위하게 작용하는 regulator 역할을 할 가능성이 있다. 본 연구는 nucleoplasmic mRNA 처리를 조절하기 위해 사전 mRNA에 결합하는 데 있어 DDX21 monomer의 glucose 활성화 역할을 강조하기 위해 rRNA 처리에서 DDX21 dimer의 알려진 기능을 추가한다.
여기서 CLIP-seq 데이터는 in vivo and in vitro 모두에서 특정 RNA 모티프인 SCUGSDGC에 대한 DDX21 결합을 식별했다. SCUGSDGC-containing RNA는 표준 DDX21 G4 RNA 서열보다 DDX21에 대해 더 높은 친화력을 보였다. splicing factor-dependent GC-rich exon은 U1 snRNP 관련 단백질에 더 의존하는 것으로 나타났으며, 우리는 glucose-dependent DDX21이 U1 snRNA에 결합하는 것을 관찰하여 GC-rich RNA splicing에 대한 DDX21의 조절이 U1 snRNA와 관련될 수 있음을 시사했다. 반면에, mRNA에 대한 DDX21 결합은 helicase 활성과 무관하며, pre-mRNA processing에서 DDX21 기능은 non-helicase mechanism을 포함한다. 이 설정에서 DDX21 동작의 메커니즘은 추가적인 해부가 필요하다. 여기서 연구된 분화 과정 외에도, glucose와 DDX21 모두 carcinogenesis에 역할을 한다. 암과 같은 특정 질병 환경에서 나타나는 조직 glucose 수치의 이상 조절이 조직 항상성의 맥락 밖에서 DDX21 기능에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 것이 흥미로울 것이다.