Germinal centers는 high- and low-affinity antibodies를 발현하는 다양한 plasma cell 집단을 clonally하게 생산합니다.
Abstract
Germinal centers (GC)는 immunization or infection 후 lymph nodes에 형성되어 antibody affinity maturation과 memory 및 plasma cell (PC) development를 촉진합니다. PC differentiation은 highest-affinity antigen receptors를 발현하는 GC B 세포에 대한 엄격한 선택을 수반하는 것으로 생각되지만, 복잡한 polyclonal responses 중에 이것이 어떻게 진행되는지는 불분명합니다.
저희는 temporal lineage tracing과 antibody characterization을 결합하여 influenza infection 중에 발생하는 PC의 스냅샷을 확보했습니다. GC는 수 배에 달하는 antibody affinities를 가진 B세포 clones을 co-mature시키지만, 각각은 weak binders를 포함하여 유사한 효율을 가진 PC를 생성합니다. 계통 내에서 PC selection은 highest-affinity antibodies를 가진 변종으로 제한되지 않습니다. Differentiation은 일반적으로 동일한 PC의 ‘nodes’를 생성하기 위한 proliferative expansion과 관련이 있습니다. Immunization-induced GCs는 더 적은 수의 PC를 생성하지만 여전히 low- and high-antibody affinities를 가집니다.
우리는 low-affinity antibody PC를 생성하는 것이 다양한 serum antibody responses를 촉진하기 위한 진화적 타협을 반영한다고 제안합니다.
Figure
high-affinity antigen receptors를 발현하는 Clonally restricted된 GC B 세포가 우선적으로 PC를 생성.
– 새로 생성된 GC-derived PCs를 식별하기 위해 S1pr2tdTom SWHEL 마우스의 B 세포를 사용
Figure 1. high-affinity BCR을 발현하는 Clonally restricted GC B 세포는 우선적으로 plasma cells를 생성합니다.
(A) (B) 및 (C)에 대한 실험 계획.
(B) immunization 후 7일째와 8일째에 tdTom+ SWHEL GC B 세포와 PC의 HEL3x-binding 비율을 보여주는 FACS.
(C) (B)의 데이터 정량화.
(D) (E) 및 (F)의 실험 계획.
(E) immunization 후 7일째와 8일째에 전체 및 c-MycGFP+ SWHEL GC B 세포(CD45.2+ IgDlow GL7+)의 HEL3x-binding 비율을 보여주는 Representative FACS.
(F) (E)의 데이터 정량화.
[Figure 1A, B] 마우스는 day 6 post-immunization 후, tamoxifen을 투여하고 1일과 2일 후에 SWHEL GC와 PC를 분석.
Cre activity가 GC-restricted되는 것과 일관되게, PC가 아닌 tdTom-labeled GC B 세포는 24시간(7일째) 이내에 분명하게 나타났으며, 8일째에는 작은 tdTom+ PC 집단이 나타남.
[Figure 1B, C] tdTom+ PC 집단은 HEL3x+ 세포가 매우 풍부했지만(중앙값 88%), 7일차 GC는 대부분 여전히 low-affinity BCRs을 발현하고(7% HEL3x+) 8일차에는 antibody affinity equivalence (45% HEL3x+)보다 훨씬 낮게 유지됨.
[Figure 1D-F] positive selection의 c-Myc-GFP reporter를 발현하는 GC B 세포 중 HEL3x+인 비율도 같은 시점에 비교했을 때에도 tdTom+ PC의 비율보다 낮았음(8일째 c-Myc-GFP+의 경우 68% HEL3x+).
- 이러한 결과는 positive selection과 PC differentiation에 대한 triggering thresholds가 다르다는 것을 확인시켜 주며, SWHEL GC에서 PC differentiation이 더 높은 친화도의 BCR을 발현하는 세포를 선호한다는 이전의 결론을 뒷받침함.
influenza A infection시 Clonally inclusive PC differentiation
– HA-specific tdTom+ GC B 세포와 PC를 FACS를 통해 분류하고, paired antibody HC 및 LC variable genes을 시퀀싱
Figure 2 influenza A infection 중 plasma cell differentiation의 clonality.
(A) (B)-(F)에 대한 실험 계획.
(B) post-tamoxifen treatment 후 표시된 시점의 14일째 MedLN GC B 세포 및 PC 중 tdTom+의 빈도.
(C) S1pr2tdTom Blimp1mVenus 마우스의 MedLN에서 HA+ tdTom+ GC B 세포 및 PC를 식별(및 분류)하기 위한 Representative FACS gating.
(D) 6마리의 마우스에 대해 (C)와 같이 정렬된 tdTom+ GC B 세포 및 PC의 clonal lineages distribution을 보여주는 원형 차트.
(E) tdTom+ PC에서 검출된 성공적인(전체의 2% 이상) GC clones의 비율.
(F) clonal lineages에 속하는 GC B 세포의 비율과 이러한 clones의 PC 비율을 비교한 GC B 세포의 2% 이하 비율.
[Figure 2A] PC differentiation을 조사하기 위해 S1pr2tdTom Blimp1mVenus 마우스를 influenza A virus (HKx31, H3N2)에 감염시키고 14일째 mediastinal (Med) lymph node (LN) harvest 3일 전에 tamoxifen 주사를 1회 투여.
[Figure 2B] tdTom 라벨링의 kinetics는 PC 라벨링이 약 1일 지연되는 등 lineage-tracing fidelity를 다시 확인시켜줌.
tdTom+ PC는 이 초기 단계에서 membrane immunoglobulins를 보유함을 확인.
[Figure 2C] multimeric fluorescent probe를 사용한 surface staining을 통해 haemagglutinin (HA)에 특이적인 세포를 확인하고 contemporaneous의 GC B 세포와 비교.
[Figure 2D] HC VDJ annotation 및 CDR3 sequence similarity를 사용하여 Unique clonal lineages를 확인. 예상대로 두 하위 집합의 세포는 대부분 여러 somatic mutations을 가지고 있었음.
대부분의 PC(중앙값 97%)는 GC에서도 관찰된 lineages로 추적할 수 있었음. 전반적으로, 약 1/3의 GC clonal lineages가 새로운 PC 집단 내에서 검출됨. 이는 드문 선택으로 인해 clonal diversity가 감소할 수밖에 없음을 나타냄.
또한, GC에서 poorly한 lineages (1% 미만의 GC B 세포로 정의됨)도 tdTom+ PC 집단에서 발견되었으며, PC 집단에는 GC에서 발견되지 않은 subdominant lineages도 포함되어 있었음.
[Figure 2E] 거의 모든 successful GC lineages (GC B 세포의 2% 이상을 차지하는 것으로 정의됨)가 tdTom+ PC(마우스 전체 중앙값 89%)에서도 발견되어 PC differentiation 과정에서 드문 특성이나 특징이 고유하게 선택될 가능성을 반증함.
[Figure 2F] GC 집단 크기에 따라 결과를 normalized했을 때, successful 및 subdominant lineages (전체 GC의 2% 이하)는 PC를 생성하는 데 있어 비슷한 생산성을 보였으며, 관찰 결과를 시뮬레이션된 무작위 샘플링과 비교했을 때 더 많은 PC를 시드하는 GC clones의 경향은 존재하지 않았음.
- 따라서, HA+ lineages가 PC를 생성하는 전체 확률은 대략 GC에서 해당 lineages의 representation을 반영.
PC는 multiple GC maturation stages에서 확장된 'nodes'로 등장.
– clonal lineages 내에서 PC differentiation을 조사.
Figure 3. Plasma cells는 multiple GC maturation stages에서 differentiation하여 nodes를 생성하기 위해 확장됩니다.
(A) Figure 2D의 Ms#1에서 표시된 clones의 Tree representation으로, GC B 세포 간의 phylogenetic relationship과 tdTom+ PC에 대해 관찰된 population sizes를 보여줌.
(B) PC 구획에 최소 5개의 고유한 VDJ 서열이 포함된 clones의 GC B 세포와 PC의 Ighv somatic mutation loads.
(C) (D) 및 (E)에 대한 실험 계획.
(D) S1pr2UBOW MedLN에서 GC B 세포(Dump/IgD- B220+ CD95+ GL7+)와 PC(Dump/IgD– CD138+)의 Representative FACS.
(E) PC node sizes (동일한 HC VDJ를 가진 세포의 수) 및 이들이 파생된 relative UBOW colors.
(F) Figure 2A와 같지만 analysis 1시간 전에 마우스가 EdU injection를 맞은 실험 계획.
[Figure 3A] GC maturation trajectories는 somatic variants가 분기된 위치(예: Ms#1 clone i의 unmutated common ancestor [UCA] 아래)를 밝힘.
[Figure 3B] PC는 GC lineage 내 여러 수준에서 발달함. 예를 들어 Ms#1 clone i는 earlier bursts의 remnants (주황색과 분홍색)를 포함하여 3개의 순차적인 GC expansions으로부터 differentiating된 PC를 가졌음. somatic mutation loads는 GC와 비교했을 때 tdTom+ PC에서 비슷하거나 더 낮았음
-PC가 상당한 확장에 의해 멀리 떨어진 multiple phylogenetic levels에서 출현했다는 발견은 PC differentiation이 가장 matured GC 세포에만 국한되지 않을 수 있음을 시사하며, 독립적인 parallel lineage branches로부터의 concurrent differentiation도 보여줌.
- 성숙 경로의 여러 단계와 가지에 있는 GC B 세포가 differentiate하여 overall maturation process을 반영하는 PC 집단을 생성.
[Figure 3C] PC nodes는 원칙적으로 특정 BCR이 multiple selection events를 트리거하거나 single PC-initiating selection event가 clonal expansion에 연결됨으로써 발생할 수 있음. 이를 확인하기 위해 유사한 S1pr2-CreERT2-based fate-mapping 실험을 수행함.
[Figure 3D] 이 환경에서 Recombination이 비효율적이어서 tamoxifen treatment 4일 후 평가했을 때 GC B 세포의 ∼2%만 라벨링.
[Figure 3E] 그럼에도 불구하고 동일한 HC VDJ 서열을 가진 세포의 상당한 크기의 PC nodes가 관찰되었으며, 대부분 단일 색상(68개 노드 중 61개)이었으며, Cre-mediated labeling 후 clonal expansion and differentiation 모두에 대해 single cells이 선택되었음을 나타냄.
[Figure 3F] 이렇게 추론된 post-selection proliferation은 PC commitment 직전 또는 직후에 발생할 수 있지만, tdTom+ PC(S1pr2tdTom Blimp1mVenus 마우스에서)는 증식성이 매우 높았음(1시간 내 ∼25% 5-ethynyl-2′-deoxyuridine [EdU]+).
- 따라서 GC는 differentiation and expansion과 관련된 과정을 통해 identical antibodies를 발현하는 PC의 nodes를 expressing합니다.
GC는 low- and high-affinity B 세포의 PC differentiation을 지원
– antibody affinity가 infection 중 GC PC differentiation에 어떤 영향을 미치는지 조사
Figure 4. low- and high-affinity BCRs을 발현하는 4GC B 세포가 plasma cells로 발달하는 과정.
(A, C, E, F) recombinant HA에 대한 monovalent Fab binding의 Affinities (KD).
(A) Figure 2의 Ms#1, Ms#3, Ms#5에 대한 다양한 clones에서 채취한 GC B 세포 및 PC의 Fab KD.
(B) Ms#1의 PC Fab에서 얻은 SPR single-cycle kinetic traces 예시.
(C) 표시된 expanded clonal lineages의 GC B 세포 및 PC에 대한 Fab KD.
(D) 3 days-tamoxifen treatment 후 감염 후 14일 또는 21일째에 채취한 MedLN의 PC generation efficiency (1,000개의 tdTom+ GC B 세포당 tdTom+ PC의 수).
(E) 3 days-tamoxifen treatment 후 감염 후 21일째에 분류된 GC B 세포 및 PC의 Fab KD.
(F) 다양한 clonal lineage의 day 21 post-infection PCs의 median KD를 추론된 UCA의 KD와 비교.
[Figure 4A, B] 서로 다른 lineages의 개별 GC B 세포는 antibody affinity가 크게 달랐으며(최대 1,000배), 대부분 100~200배 범위에 걸쳐 있었음. 놀랍게도 tdTom+ PC에서 관찰된 affinity spread는 GC와 유사.
- 중요한 것은 weak affinity BCR을 가진 GC B 세포가 higher-affinity antigen receptors를 발현하는 세포와 경쟁할 때도 differentiated될수 있다는 것을 의미.
[Figure 4C] clonal lineages 내에서 BCR affinity와 PC differentiation 사이의 관계를 조사.
Individual clones은 예상대로 상당한(∼10~30배) affinity ranges를 지원했지만 lineages 간에는 덜 broad함.
somatic variants와 UCA를 비교한 결과, GC가 positive selection을 통해 비교적 완만한 affinity enhancements을 읽고 촉진한다는 사실이 입증(예: Ms#1 clone i, Ms#3 clone vii, Ms#5 clone xiii). 그럼에도 불구하고, 상대적으로 넓은 범위의 clone (예: Ms#3, KD가 ∼40배에 이르는 clone ix)과 lower-affinity의 clone (예: Ms#1 clone iii 및 Ms#5 clone xi)을 포함하여, tdTom+ PC Fab은 동일한 lineages의 GC B 세포와 affinities 측면에서 거의 유사하게 나타남.
[Figure 4D] GC 크기로 normalized된 Overall PC output은 약 4배 감소했으며, 이로 인해 뚜렷한 lineages 수와 somatic variants 모두에서 tdTom+ PC 다양성이 약간 감소함.
[Figure 4E] overall response affinity는 maturation 1주일이 추가되면서 훨씬 개선되었지만(∼600nm 범위와 비교하여 ∼20nm), large interclonal affinity spreads는 여전히 GC에서 분명하게 나타났고 PC differentiation 중에 보존됨(예: Ms#7의 clone xvi 및 xvii는 모두 clone xvii가 우세함에도 불구하고 PC를 생성함)
clonal lineages 내에서 가장 낮게 검출된 GC antibody affinities와 일치하는 PC가 여전히 발견되었으며, maturation pathway의 여러 수준에서 differentiation이 다시 발생함. 일부 clones은 균일하게 더 적은 돌연변이(예: 비교적 낮은 친화도를 가진 Ms#7 clone xvii)를 가지고 있었음.
- 이는 기존 GC에 infiltrating한 세포가 성공적으로 PC를 만들기 시작했음을 시사.
[Figure 4E] 후기 단계의 GC는 더 적은 수의 PC를 생성했지만 유사한 selection rules을 가지고 있었음. 중요한 것은 상대적으로 antibody affinity이 약한 clones에서 생성된 PC도 UCA에 비해 훨씬 개선되었다는 점임.
- 이는 이러한 방식으로 PC를 선택하는 것이 진화적으로 유리하다는 것을 나타냄.
single GC에 대한 PC differentiation tracking.
– single GC에서 low- and high-affinity PC의 concurrent generation이 사실인지 조사
Figure 5. single GCs로 plasma cell differentiation tracking하기
(A) (B)-(F)의 실험 계획.
(B) single tdTom+ GC의 pre- and post-photoconversion의 Multi-photon microscopy image.
(C) HA+ tdTom+ PC와 HA+ PAGFP+ single GC B 세포를 분류하기 위한 Representative FACS gates.
(D) PC를 individual GC로 추적할 수 있는 두 마우스의 clonal lineages distribution을 보여주는 원형 차트.
(E) (D)에 표시된 clones에 대한 Phylogenetic maturation trees (GC).
(F) indicated clones (GC 및 PC)의 Fab의 HA에 대한 1가 Monovalent affinities (KD).
[Figure 5A-C] two-photon-microscopy-mediated photoactivatable GFP (PAGFP) approach를 채택하여 individual GC를 in situ에서 표시하고 FACS로 B 세포를 분류함.
[Figure 5D, E] PC는 2개의 GC로 성공적으로 추적되었으며, colored GC pie slices와 colored GC tree variants으로 differentiation이 발생한 위치를 표시함. PC는 dominant winner clones (예: Ms#10 clones i)과 GC에서 경쟁이 덜한 clones (예: Ms#10 clones ii 및 Ms#11 clones vi) 모두에서 차별화됨.
[Figure 5F] Ms#10 clones i-iii 및 Ms#11 clones iv-vi의 여러 GC B 세포와 PC에 대해 Fab을 발현하고 이들의 친화도를 비교함. Ms#10의 clones i과 ii는 affinities 중앙값이 ∼15배(116 nM vs 1.8 μM) 차이가 났지만 둘 다 PC를 생성함.
- 이 단일 GC에서 추적된 최고 및 최저 antibody affinity PC는 2.7 nM 및 13 μM로, 이는 동시에 ∼4,000배의 antibody affinity 차이를 가진 PC를 생성했음을 시사.
Immunization-induced GCs는 생산성은 떨어지지만 antibody affinities가 다른 PC의 development을 지원.
– subunit vaccination에 반응하여 형성된 GC에서도 유사한 PC selection rules이 적용되는지 조사
– GC B 세포와 tdTom+ PC의 HA-binding Fab의 affinities를 측정
Figure 6. GC는 immunization 후 더 적은 수의 plasma 세포를 생산하지만 여전히 서로 다른 antibody affinitie를 보임.
(A) (B)에 대한 실험 계획.
(B) infection or immunization 후 표시된 시점의 GC size-normalized PC output (1,000개의 tdTom+ GC B 세포당 tdTom+ PC의 수).
(C) (D) 및 (E)의 실험 계획.
(D) tdTom+ GC B 세포 중 Blimp1+ IRF4+ 세포의 비율을 보여주는 Representative FACS.
(E) (D)의 정량화.
(F) 3 days of tamoxifen treatment 후 day 14 post-HA/AddaS03 immunization에 tdTom+ GC B 세포 및 PC의 antibody gene을 시퀀싱했습니다.
(G) (F)에 표시된 clones에 대한 Phylogenetic maturation trees와 tdTom+ PC에 대한 관찰된 population sizes.
(H) 분석된 10개의 모든 LN에 걸쳐 GC에서 두개의 most immunodominant clones의 GC B 세포와 tdTom+ PC의 Ighv somatic mutation loads.
(I) 3 days-tamoxifen treatment 후 day 14 post-HA/AddaS03 immunization에 GC B 세포와 tdTom+ PC 중 HA-binding and non-binding cells의 비율을 보여주는 Representative FACS.
(J) (I)의 정량화.
(K) 다양한 clones을 반영하여 표시된 집단에서 Fab에 의한 HA binding에 대한 KD.
(L) (K)의 한 마우스에서 high and low affinity PC Fabs의 SPR single-cycle kinetic traces.
[Figure 6A] S1pr2tdTom Blimp1mVenus 마우스를 AS03-like adjuvant (AddaS03)에 recombinant HA protein을 subcutaneously (s.c.)로 immunized시킨 후, 새로 생성되는 PC의 특성을 다시 분석함. [Figure 6B] immunization 후 PC production efficiency는 현저하게 감소했으며, GC 크기에 따라 결과를 정상화했을 때에도 infection 시보다 훨씬 적은 수의 PC를 생성(14일째 17배 감소).
[Figure 6C] tamoxifen treatments가 어느 정도 differentiation을 허용하되 proliferation및/또는 apoptosis로 인한 secondary effects를 최소화해야 한다는 근거에 따라 tamoxifen treatments를 더 짧게(30시간) 한 추가 GC fate-mapping experiments을 수행함.
[Figure 6D, E] 유사한 tdTom-labeling kinetics에도 불구하고 infection 중에 IRF4high 및 Blimp1+인 tdTom+ GC-phenotype 세포의 비율이 훨씬 높았으며, 이는 해당 환경에서 differentiation이 더 자주 시작되는 것과 일치함
[Figure 6F] immunization-induced GC가 더 적은 수의 PC를 생성했음에도 불구하고, 우세하고 지배적인 GC clonal lineages가 다시 differentiation됨.
[Figure 6G, H] PC differentiation은 다시 overall clonal maturation process를 대략적으로 반영했는데, 이는 tdTom+ PC sequences가 phylogeny의 여러 수준에 매핑되고 Ighv somatic mutation levels이 GC에 비해 tdTom+ PC에서 비슷하거나 약간 낮았기 때문임.
[Figure 6I, J] HA/AddaS03 immunized 마우스의 GC에서 HA FACS probe negative (HA-) 세포가 분명하게 나타났으며, 이들은 또한 tdTom+ PC가 됨.
[Figure 6J] HA- 세포가 differentiation되는 상대적 효율은 마우스마다 달랐지만, 모든 마우스/실험을 합쳤을 때 HA+ GC 세포가 훨씬 더 많은 PC를 생성함 (GC에서 HA+ 중앙값 39%, tdTom+ PC에서 56%).
- damaging 또는 dead-end mutations을 지닌 세포가 GC 집단에 존재하면 이러한 효과에 기여할 수 있음. 그러나 이는 또한 HA multimers의 검출 가능한 결합을 부여하기 위해 최소 affinity thresholds에 도달하는 세포의 우선적(배타적이지는 않지만) differentiation을 반영할 수도 있음.
[Figure 6K, L] 여러 clonal lineages의 Fab을 분석했을 때, GC B 세포와 tdTom+ PC의 antibody affinities는 모두 1000배이상에 달함.
- 종합적으로, infection과 immunization에 대한 우리의 결과는 GC PC differentiation을 유도하는 선택적 기준이 affinity maturation을 유도하는 기준을 거의 따라간다는 것을 나타냄.
Disscussion
우리의 연구는 antibody affinity와 GC B 세포 clonality가 complex responses 동안 GC PC differentiation에 어떤 영향을 미치는지 보여줍니다. clones적으로 제한된 anti-HEL3x 반응에 대한 연구에서는 high-affinity GC B 세포만 PC로 differentiation되는 강한 편향성이 나타났습니다(Phan 외.5, Figure 1 참조). 이와는 대조적으로, influenza infection 후 형성된 GC는 antibody affinity가 매우 다른 B세포 clones을 co-mature시켜 동시(또는 곧) 형성될 GC를 거의 반영하는 PC 집단을 산출한다고 보고했습니다. 놀랍게도 이는 GC가 affinity가 약한 것으로 간주될 수 있는 antibodies를 발현하는 PC를 생성한다는 것을 의미하며, West Nile virus immune 마우스의 최근 연구 결과를 설명합니다. 따라서 우리는 PC selection이 지나치게 제한적이지 않고 affinity maturation process를 이끄는 선택 환경을 광범위하게 반영한다는 결론을 내립니다. 또한 실험 결과, PC differentiation은 GC에서 드물게 발생하지만 일반적으로 PC proliferation을 수반하는 광범위한 clonal expansions과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 이는 antibody secretion을 촉진하고 PC가 멀리 떨어진 supportive niches에 도달하여 장기 생존할 수 있는 가능성을 높일 수 있습니다. 우리의 실험 요법에는 모두 FTY720 치료가 포함되었지만, sphingosine-1-phosphate receptor 1 antagonism 없이도 LN 배출 후에도 clonal expansion이 계속될 수 있다는 것은 그럴듯한 사실입니다.
다른 모든 것이 동일할 때 가장 친화력이 높은 BCR을 발현하는 GC B 세포만 PC differentiation를 위해 선택된다는 아이디어는 antibodies가 기능적으로 낮은 농도에서 targets을 saturate시킬 것으로 예상되기 때문에 매력적이었습니다. 그러나 antibodies potency는 neutralizers 간에도 결합된 epitopes와 관련된 molecular interactions에 따라 크게 달라집니다. 이러한 이유로 antibody affinity와 potency 사이의 상관관계는 clones 간을 고려할 때 매우 낮을 수 있으며, SARS-CoV-2 B 세포의 경우 epitopes potency를 측정할 방법이 없으므로 GC가 과도한 편향 없이 광범위한 샘플을 PC 풀로 전송하면서 친화도가 다른 clones을 co-mature시키는 것이 진화론적으로 합리적이라고 제안합니다. 또한, bivalent nature로 인해 결합률이 상당히 높고 양쪽 팔에 모두 결합하는 antibodies는 실제로 세포 사이를 이동하는 바이러스와 같이 표적이 일시적으로만 노출되는 경우 중간 정도의 affinities (예: KD ∼100-10 nM 이상) 이상으로 개선하여 거의 이점을 얻지 못할 수 있습니다. 이 선택 접근법은 epitopes와 binding modes의 중복성을 보장하여 pathogen immune escape에 대응하는 데도 도움이 될 수 있습니다. 특히, 21일째에 상대적으로 약한 Fabs도 예측된 UCA에 비해 훨씬 개선되어 전반적으로 반응이 개선되었음을 알 수 있었습니다.
GC에서 PC commitment를 촉발하는 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. clones적으로 제한된 환경에서 BCR affinity와의 현저한 연관성은 LZ 세포가 매우 강력한 selection inputs을 받을 때 PC differentiation이 GC에 계속 참여하기 위한 의무적인 alternative fate choice로 발생한다는 제안을 이끌어냈습니다. 이 단계에서 differentiation를 포함하는 모델에 대한 한 가지 개념적 우려는 GC가 생성 직후 높은 BCR affinity세포를 스스로 고갈시킬 위험입니다. 실험적 증거는 또한 강력한 selection inputs이 다른 하나를 희생하여 두 운명을 동시에 촉진하는 것이 아니라 두 운명을 동시에 촉진한다는 것을 뒷받침합니다. 따라서 다른 가능성은 PC(또는 이 운명에 민감해진 세포)가 affinity maturation을 형성하는 proliferative events의 이차적 산물로 발전할 수 있다는 것입니다. 이 시나리오에서 딸세포는 GC expansions으로부터 떨어져 나와 PC 운명으로 향하게 될 수 있습니다. 이는 follicular dendritic세포에 antigen이 부족하고 GC B 세포의 BCR signaling capacity가 저하된 것으로 추정됨에도 불구하고, T 세포의 도움 없이도 BCR 결합 후 일부 GC B 세포에서 Blimp1 유도가 가능한 이유를 설명할 수 있습니다. interleukin (IL)-21이 PC differentiation를 촉진하는 방향으로 선택을 “re-wires”한다는 최근의 증거 및 이 T-cell-derived cytokine이 immune synapses 외부에서 작용한다는 증거는 세포의 운명이 local microenvironment과도 연관될 수 있음을 시사하므로 확률적 과정과 지시적 과정 사이의 다리를 제공할 수 있습니다.
Limitation of the study
본 연구에서는 clones 내 및 clones 간의 세포(Fab characterization을 위해)를 적당히 큰 규모로 샘플링했지만, 모든 세포에 대해 샘플링할 수는 없었습니다. 따라서 이 결과는 GC와 새로운 PC 집단에 존재하는 affinities에 대한 개요를 제공하지만 average antibody affinities를 완전히 정량적으로 비교한 것으로 해석해서는 안 됩니다. HA+ GC와 tdTom+ PC 집단에 의해 인코딩된 antibody affinity의 확산이 유사하다는 결론을 내렸을 뿐, 동일하다는 의미는 아닙니다. 운명 매핑에 내재된 time lag는 또한 PC differentiation를 GC phylogeny에 할당할 수 있는 comparisons과 resolution을 제한합니다.
우리는 비교 SWHEL 실험을 통해 positive selection의 c-Myc markers induction에 대한 antibody affinity threshold가 PC differentiation에 대한 threshold과 다르다는 결론을 내렸습니다. mTorc1 활성화 또는 CylinD3 유도 등 다른 선택 관련 경로는 평가하지 않았습니다. 다양한 선택 경로는 sequential clonal burst를 통해 affinity maturation을 유도하기 위해 non-binary dose-dependent manners로 함께 작동하며, 따라서 c-Myc 유도는 positive selection의 마커이지만, 그 발현만으로는 affinity maturation을 이끄는 selective pressure의 척도를 제공하지 못합니다. 이러한 clonally restricted responses는 affinity가 매우 빠르게 성숙하므로 selection rules이 반응 단계에 따라 다를 가능성도 배제할 수 없습니다.
