From primordial clocks to circadian oscillators

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2년 ago

원시 시계에서 일주기 진동자까지

Abstract

일주기 리듬(Circadian rhythms)은 많은 생물학적 과정에서 필수적인 역할을 하며, 진정한 post-translational 일주기 진동자(circadian oscillator)를 구성하기 위해 단 세 개의 원핵 단백질을 필요로 합니다. 3개의 Kai 단백질의 진화 역사는 KaiC가 가장 오래된 구성원이자 시계의 중심 구성 요소임을 나타냅니다. KaiB와 KaiA의 후속적인 추가를 통해 바깥 세계의 시간과 동기화를 하며, 이를 위해 KaiC의 인산화 상태를 조절합니다. 표준 KaiABC 시스템은 Cyanobacteria 수준에서는 잘 이해되고 있지만, KaiBC만 보유한 더 오래된 시스템에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 하지만, 원시적인 시스템에도 기본적인 모래시계 같은 시간 기록 메커니즘을 보일 수도 있다는 보고가 있습니다.

이 논문에서는 KaiA가 누락되었음에도 불구하고 내부 작동을 설명하기 위해 KaiBC만 포함하는 Rhodobacter sphaeoides의 원시 일주기 시계를 조사합니다. 연구진들은 X선 결정학과 극저온 전자 현미경(cryogenic electron microscopy)을 결합하여 KaiC에 대한 새로운 dodecameric fold를 발견했습니다. 여기서 두 개의 육각형이 12개의 나선으로 구성된 코일 다발에 의해 함께 고정되는 방식을 활용합니다. 이러한 상호작용은 KaiC의 카복시(carboxy-) 말단 확장에 의해 형성되며, 나중에 KaiA로 대체되는, 예로부터 존재해왔던 조절 부분 역할을 합니다. 주간과 야간 형태 사이의 coiled-coil register shift는 140 Å 이상에 걸쳐 있는 장거리 allosteric network를 통해 인산화 부위에 연결됩니다.

연구진들의 역동 데이터는 시계를 움직이는 환경 신호로서 낮과 밤 사이의 ATP 대 ADP 비율의 차이를 식별합니다. 이들은 또한 자체 유지 진동자의 진화를 밝히는 기계적 디테일을 설명합니다.

Figure

[Figure 1] KaiCRS의 확장된 C-terminal tail은 KaiA와 독립적인 KaiC의 인산화를 위해 노출된 A loop와 coiled-coil interaction을 형성한다
a. kaiC의 유전자 계통 나무 모식도로, kaiB 및 kaiA의 진화적 조상을 나타냅니다.
b. KaiCRS의 시간 당 인산화 비율, 그리고 KaiASE가 존재하지 않을 때 30°C에서 KaiCSE의 인산화 비율을 나타냅니다.
c. KaiCRS와 KaiCSE의 mant-ATP와 ATP 간 핵산교환 속도를 나타냅니다.
d. 12분자형 KaiCRS의 X선 구조입니다. 12분자형 KaiCRS의 X선 구조는 hexamer A (연두색) 및 hexamer B (진한 녹색)으로 색칠되어 있으며, CI, CII 및 나선물결 도메인이 표시되어 있습니다.
e. KaiCRS, KaiCSE 및 KaiCSE-S431E/T432A의 CII 도메인의 비교를 위한 그림으로, KaiCRS의 CII domain alignment 정보를 통해 그렸습니다.

[Figure 2] CII 도메인의 allosteric network에 결합된 coiled-coil 파트너 스위치는 autodephosphorylation을 촉진한다
a. KaiCRS-Matrix 코일의 X선 구조는 C2221 공간군에서 해결됐으며 비대칭 단위에 3개의 monomers가 포함됐으며, ADP는 모든 활성 부위에 존재합니다.
b. PISA 소프트웨어를 사용한 어셈블리 분석 결과, hexamer의 형성이 가장 가능성이 높은 4차 구조로 나타났습니다 (top view).
c. 인산화되지 않은 KaiCRS와 KaiCRS-S413E/S414E phosphomimetic mutant의 나선상 도메인 구조 비교입니다.
d. c의 구조의 상호 작용하는 이차체들의 겹침 구조를 보입니다.
e. 인산성 모방체 상태에서의 (파란색) 나선 (연한 파란색)에서 KaiCRS CII 도메인을 통해 활성부위 (짙은 파란색)로 전파되는 allosteric network입니다.
f. 4mM ADP가 존재하는 환경에서 30°C에서 KaiCRS와 KaiCRS-Δcoil의 시간 경과에 따른 자동 인산화의 결과입니다.

[Figure 3] KaiCRS의 Phosphorylation-dephosphorylation cycle에서 KaiBRS의 억제 역할
a, 35°C에서 3.5 μM KaiBRS 및 4mM ATP에 대한 SDS-PAGE gel의 상태로, 3.5 μM KaiCRS 가 없는(위), 그리고 있는(아래) 조건입니다.
b. KaiBRS가 존재하지 않는(회색 원), 그리고 존재하는(붉은 다이아몬드) 상태에서의 KaiCRS phosphorylation (single & double) 상태입니다.
c. 3.5 μM KaiCRS 의 phosphorylation–dephosphorylation cycle을 나타냅니다. 3.5 μM 인산화 KaiCRS 의 존재 여부에 따라 결과를 나누었으며, ATP-to-ADP ratio는 낮(high ATP)과 밤(25% ATP)의 환경을 고려하여 조절했습니다.
d. 30°C에서 KaiBRS가 없는 경우 wild-type KaiCRS의 ATPase 활성, KaiCRS가 없는 경우 KaiCRS-E62Q/E63Q, KaiCRS가 없는 경우 KaiCRS-E302Q/E303Q를 보여줍니다.
e. 30°C에서 20μM KaiBRS 및 4mM ADP가 존재하는 상태에서 ADP와 결합된 32P 레이블 KaiCRS의 시간 의존적 autophosphorylation를 보여주며, 인산화된 32P-KaiCRS, 32P-ATP 및 유리 32Pi를 보여줍니다.
f. 4 mM ADP로 결합된 인산화된 32P-KaiCRS의 붕괴를 보여주며, 30°C에서 KaiBRS의 부재(회색 원)와 존재(적색 다이아몬드)에 따라 나누어 보여줍니다.
g. 3.5μM KaiCRS (회색) 및 3.5μM KaiCRS + 30μM KaiBRS (빨간색)의 뉴클레오타이드 변화를 보입니다. mant-ATP 를 포함한 ATP가 존재하는 조건입니다.

[Figure 4] KaiBRS는 post-hydrolysis 상태에 결합하며, KaiCRS의 ATPase activity를 가속화한다
a. KaiBRS(파란색)와 복합된 KaiCRS-S413E/S414E(노란색)의 Cryo-EM 구조입니다.
b. KaiCRS-S413E/S414E(노란색)가 KaiBRS(파란색)에, KaiCTE-S413E(진회색)가 fsKaiBTE에 결합된 중첩입니다.
c,d. KaiBRS(파란색)의 결합은 CI domain에서 ATP 가수분해를 위한 촉매 위치(빨간색)에 수분이 도달할 수 있도록 하는 터널(회색)을 생성합니다.
e. 25°C에서 ADP 또는 ATP 재활용 시스템이 존재하는 상태에서 wild-type 및 mutant 형태의 KaiCRS와 His-tagged KaiBRS 의 결합을 보여줍니다.
f. unphosphorylated KaiCRS에서 KaiBRS-6IAF를 완전히 제거하는 unlabeled KaiBRS의 Fluorescence anisotropy입니다.
g. KaiCRS가 coiled-coil interaction 및 CI, CII domain에서 KaiBRS에게 영향을 받는 메커니즘의 모식도입니다.

Disscussion

이 논문에서 연구된 KaiBCRS 시스템은 원시적인 모양의 시간 유지 장치이며, 이는 KaiABC와 같은 진화된 circadian oscillators 대한 통찰력을 제공합니다. Dodecameric KaiCRS는 상대적인 hexamer와 공명하는 C-터미널 꼬임 묶음을 형성하여 constitutive kinase 활동을 나타냅니다. 이 구조는 KaiACSE의 노출된 A 루프 형태와 유사한 형태를 유발하며, 자가 인산화는 30분 이내에 발생합니다. KaiABCSE 시스템에서는 무인산 상태에서 이중 인산화 된 KaiC로의 전환이 약 12시간 동안 발생하며, 이번 첫 번째 절반의 순환 리듬을 미세 조정하는 것은 진화 과정에서 KaiASE의 등장으로 이루어집니다. 두 번째 시간 단백질인 KaiB는 두 시스템 모두에서 동일한 접힘 교환 상태로 CI 도메인에 결합합니다. 상호작용은 KaiABCSE 시스템에서 인산화 상태로 제어되며, 그 유일한 기능은 활성화 결합부위에서 KaiASE를 격리시키는 것이며, 반면 KaiB 결합은 인산화 상태와 상관없이 KaiBCRS 시스템에서 ATPase 활동을 직접 가속화합니다. KaiBCRS 시스템은 시계를 재설정하기 위해 ATP에서 ADP 농도로 환경 스위치가 필요합니다. 따라서 시스템은 유기체 내에서 원래 농도가 흔들리는 낮-밤의 순환 일정을 따릅니다. 반면, 자체 지속 진동 궤도인 KaiABCSE는 넓은 범위의 뉴클레오타이드 농도에서도 작동하며 ATP-ADP 비율의 변화에 대응하여 인산화 주기와 진폭을 변경하여 낮-밤 사이클에 맞게 조정됩니다.

최근 보고된 KaiC의 구조적인 접힘 방식은 다양한 조절 기능을 가진 멀리 떨어져 있는 allosteric network의 일부로서 유연한 coiled-coil 구조를 이용합니다. 자연은 코일-코일 도메인의 구조 변화를 통해 다양한 조절 기능을 수행하는데, 이는 세포 내에서 활동하는 모터 니들린이 아큰 필라멘트를 따라 물질을 운반하는데 활용되는 것과 같습니다. dynein motility에서도 단 두 개의 나선으로 이루어진 coiled-coil 상호작용에서 비슷한 register shift가 사용됩니다. 이러한 간단한 7개의 반복 단위로 이루어진 서열은 여러 번 발생하며, 모든 생물군에 걸쳐 발견되므로 수렴적 진화(convergent evolution)의 예시라고 할 수 있습니다.

REF

Pitsawong, W., Pádua, R.A.P., Grant, T. et al. From primordial clocks to circadian oscillators. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05836-9