Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo

tRNA 설계를 통해 세포 및 생체 내 nonsense mutation을 억제하다

[EzV] Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo

Abstract

Nonsense mutation은 모든 유전적 질병의 약 11%의 근본적인 원인입니다. Nonsense mutation은 tRNA에 의해 디코딩된 sense codon을 조기 종결 코돈(PTC; premature termination codon)으로 변환하여 translation 과정을 갑작스럽게 종료시킵니다. Nonsense mutation을 억제하는 한 가지 전략은 새로 등장한 PTC에 염기쌍을 맞추고 번역을 촉진하기 위해 변경된 anticodon이 있는 natural tRNA를 사용하는 것입니다. 그러나 tRNA 기반 유전자 치료는 임상적 효능과 안전성의 최적 조합을 산출하지 못했으며 현재 nonsense mutation을 가진 개인에 대한 치료법은 존재하지 않습니다.

이 논문에서는 염기서열을 운반하는 아미노산의 물리화학적 특성에 따라 개별적으로 미세 조정함으로써 natural tRNA를 효율적인 억제 RNA(sup-tRNAs; suppressor tRNAs)로 변형하는 전략을 소개합니다. 생쥐에서 sup-tRNA의 정맥 및 기관 내 지질 나노입자(LNP; lipid nanoparticle) 투여는 nonsense mutation을 가진 기능성 단백질의 생산을 복원했습니다. LNP-sup-tRNA 제형은 리보솜 프로파일링에 의해 결정된 endogenous native stop codons에서 식별 가능한 판독을 유발하지 않았습니다. 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절 유전자(CFTR; cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene) 내에 임상적으로 중요한 PTC에서 sup-tRNA는 세포 시스템과 환자 유래 비강 상피에서 발현과 기능을 재정립하고 기도 용적 항상성을 복원했습니다.

이러한 결과는 표적 PTC 억제에서 높은 분자 안전 프로파일과 높은 효능을 가진 tRNA 기반 치료법 개발을 위한 기반을 제공합니다.

Figure

[Fig1] Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo

[Figure 1] Sup-tRNA 변형은 Ser 및 Arg 코돈에서 서로 다른 PTC를 억제한다
a. (왼쪽) 인간 tRNASerUGA, tRNASerAGA 또는 tRNAArgUCU의 natural anticodon을 사용한 일반 tRNA 도식입니다. Anticodon(AC)-stem(Ai variants; 아래) 및 TΨC-stem(Ti variants; 오른쪽)은 붉은 색으로 표시했습니다.
b. PTC 돌연변이(PTC-FLUC)를 가진 반딧불 luciferase(FLuc)를 인코딩하는 플라스미드 구조를 가진 sup-tRNA screening에 대한 도식입니다.
c. FLUC(R208X)에서 인간 간 Hep3B 세포에서 tS 또는 tR 변이체의 억제 효능입니다. (X가 UGA를 나타냄) Wild-type FLuc으로 normalize되었습니다.
d. tSA1T5는 서로 다른 종결 코돈을 통해 PTC를 타깃합니다. 인간 기관지 상피세포인 CFBE41o- cell 내의 Fluc(S466X)으로 테스트했으며, wild-type FLuc으로 normalize했습니다.
e. tSA2T5에 의한 TLR 의존적 활성화는 인간 TLR 변환 HEK293 세포에서 모니터링되었습니다. TLR7과 TLR8을 모두 활성화시키는 R848 작용제는 양성대조군으로 작용하였습니다.

[Fig2] Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo

[Figure 2] 마우스에서 LUNAR 캡슐화 sup-tRNA에 의한 생체 내 PTC 억제
a. PTC reporter mRNA 및 sup-tRNA를 함께 캡슐화한 LUNAR LNP의 정맥(i.v.) 또는 기관 내(i.t.) 투여 과정의 모식입니다.
b. IVIS 생체 내 영상(오른쪽)에서 sup-tRNA로 처리된, aLuc(R208S) 마우스에 비교한 Luc(R208X) 마우스의 신호 비율로 표시되는 PTC 판독값의 정량화된 값(왼쪽)을 나타냅니다.
c. tRNA 마이크로 어레이로 모니터링되는 간의 sup-tRNA 안정성에 대한 boxplot입니다.
d-g. LUNAR2 LNP로 처리된 유전자 변이 mouse의 폐에서 tdTomato 발현(암갈색 반점)을 보여주는 bright-field immunohistochemistry입니다. (d) WT-cre, (e) PTC-cre, (f) PTC-cre + tSA1T5, (g) mistmatch tRNA)
h. wild-type cre 또는 PTC-cre를 tSA1T5 처리로 운반하는 LUNAR2 제제를 투여한 마우스에서 tdTomato(tdT) 및 섬모(FOXJ1) 및 분비계(MUC5B) 상피 세포 마커의 immunofluorescence 결과입니다.

[Fig3] Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo

[Figure 3] 세포 모델에서 mRNA 번역 및 단백질 기능의 PTC 억제 및 복원
a. CFBE41o-세포에서 CFTR(S466X), CFTR(R533X) 또는 CFTR(R1162X)(X: UGA 코돈을 나타냄)에서 full-length CFTR의 발현을 복원하는 tS 및 tR 변이체의 유효성을 나타냅니다. Immunoblot을 통해 모니터링한 결과입니다.
b. CFBE41o 세포의 wild-type CFTR mRNA와 비교하여, ribosome profiling에 의해 모니터링되는 tRT5 억제 CFTRR553X mRNA translation의 ribosome density profile입니다.
c. Wild-type CFTR을 발현하는 cell과 비교하여 tR 또는 tRT5로 transfection된 CFTR(R553X) 및 CFTR(R1162X) 발현 FRT cell monolayer의 단락 전류(ΔIsc; short-circuit current)입니다.

[Fig4] Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo

[Figure 4] NMD와 경쟁하여 CFTR 발현 및 활성을 회복하는 과정
a,b. NMD 억제제(NMDi, 5µM NMD14)를 사용한 치료와 비교한 tR 또는 tRT5의 효능입니다.
c. (왼쪽) CFTRR1162X/R1162X HNE 세포(X: UGA)에서 CFTR 단백질 발현의 복원을 위한 NMD 억제제(5µM NMD14)가 있거나 없는 상태에서의 tRT5 효능입니다. (오른쪽) CFTR 유전자에 대해 wild-type인 non-cystic fibrosis 환자의 hNE 세포에서의 CFTR 발현입니다.
d. (왼쪽) CFTRR1162X/R1162X hNE 세포(X:UGA)의 단락 전류 측정을 tRT5 단독 또는 tRT5 + NMD inhibitor(0.5 µMSMG1)를 사용하여 비교한 결과입니다. (오른쪽) CFTR 유전자에 대해 wild type인 non-cystic fibrosis HNE 세포의 단락 전류 값입니다.
e. tRT5 또는 mismatch tRNA와 함께 transfection된 CFTRR1162X/R1162X hNE 세포(X:UGA)의 ASL height 측정 결과입니다. Wild type 세포의 CFTR 발현과 비교했습니다.

Disscussion

이 논문에서는 임상적으로 중요한 nonsense mutation을 효율적으로 디코딩하기 위해 native tRNA가 수정될 수 있음을 보여줍니다. UAA PTC를 교정하기 가장 어려운 것을 포함하여 다양한 nonsense mutation 유래 PTC를 디코딩하기 위한 tRNA의 엔지니어링에는 디코딩 정확도(안티코돈 줄기 돌연변이 활용) 및 elongation factor에 대한 결합 친화력을 변조하는 tRNA sequence를 변경하는 것이 포함됩니다. 이는 PTC에 삽입될 아미노산의 개별적인 열역학적 기여 측면에서 하나의 큰 분류로 묶일 수 있습니다. 연구진들은 낭포성 섬유증을 일으키는 PTC에서 최적화된 억제 RNA 단독으로 단백질 발현과 기능, 기도 부피 항상성을 복원하여 낭포성 섬유증 환자에게 잠재적인 임상적 이점을 제시한다는 것을 보여주었습니다. 이 경우 보조제로서 NMD 억제제를 추가할 필요가 없을 수 있습니다. NMD 억제제가 PTC 억제 전략을 위한 운동 창을 연장할 수 있지만, 유전자 발현의 광범위한 잘못된 조절을 방지하기 위해 NMD를 차단하기 위한 치료와 선량을 신중하게 조정해야 합니다.

따라서 본 연구는 nonsense mutation으로 인한 유전성 질환의 정밀하고 개별화된 치료법을 발전시키기 위한 수단으로서 개별 PTC 맥락과 관련 아미노산으로 형성된 지질 나노입자로서 투여를 위한 tRNA 기반 PTC 억제제 개발을 위한 프레임워크를 제공합니다.

REF

Albers, S., Allen, E.C., Bharti, N. et al. Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06133-1