암의 공간 및 세포 이질성에 대한 종양 내 미생물군의 영향
Abstract
종양 관련 미생물군은 인간 암 유형 전반에 걸친 종양 미세 환경의 본질적인 구성 요소입니다. Intratumoral host-microbiota 연구는 지금까지 벌크 조직 분석에 의존해 왔으며, 이는 종양 내 미생물군의 공간적 분포와 국소화 효과를 모호하게 합니다.
이 연구에서 in situ 공간 프로파일링 기술과 single-cell RNA-sequencing을 구강 편평 세포 암과 결장직장암에 적용하여 공간적, 세포적, 분자적 host–microbe 상호 작용을 밝힙니다. 우리는 10x Visium spatial transcriptomics를 적용하여 환자 조직 내에서 종양 내 미생물 군집의 정체성과 in situ localization을 확인했습니다. GeoMx 디지털 공간 프로파일링을 사용하여 우리는 박테리아 음성 종양 영역과 비교하여 낮은 수준의 Ki-67을 가진 악성 종양 세포와 연관되고 덜 혈관발생 되고 면역 억제성이 높은 microniches에 박테리아 커뮤니티가 있음을 보여줍니다. 우리는 INVADEseq (invasion–adhesion-directed expression sequencing)라는 이름의 single-cell RNA-sequencing 방법을 개발했으며, 이를 환자 종양에 적용하여 세포 관련 박테리아와 이들이 상호 작용하는 숙주 세포를 식별하고 염증, 전이, 세포 휴면, DNA 복구와 관련된 전사 경로의 변경을 확인했습니다. 기능 연구를 통해 세균에 감염된 암세포가 단세포로서 주변 환경에 침입하여 세균 영역으로 골수 세포를 모은다는 것을 보여줍니다.
우리의 데이터는 종양 내 미생물군의 분포가 무작위가 아니라는 것을 보여줍니다. 대신 암 진행을 촉진하는 면역 및 상피 세포 기능을 가진 microniches로 고도로 조직화되어 있습니다.
Figures
Fig 1. 종양 조직 전체에 걸친 종양 내 박테리아의 공간적 분포를 평가합니다.
(A) 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색(왼쪽), 인간 OSCC 및 CRC 표본의 10x Visium 캡처 슬라이드에서 종양 조직 전체의 총 박테리아 판독값(가운데) 및 총 UMI 전사체(오른쪽)의 공간 분포.
(B) OSCC 및 CRC 종양의 10x Visium RNA 시퀀싱 데이터에서 검출된 상위 10개의 가장 지배적인 박테리아 속의 파이 차트.
(C) RNAscope-FISH 이미징은 10x Visium 섹션을 따르는 순차적 슬라이드에서 종양 조직에 걸쳐 박테리아의 분포를 보여줍니다. F. nucleatum 프로브는 빨간색이고 eubacterial 프로브는 청록색입니다. 눈금 막대, 1mm.
(D) 10x Visium OSCC 표본 데이터에서 검출된 Parvimonas, Peptoniphilus 및 Fusobacterium UMI의 공간 분포.
(E) 10x Visium CRC 표본 데이터에서 검출된 Fusobacterium, Bacteroides 및 Leptotrichia UMI의 공간 분포.
Fig 2. 국소 microniches에서 종양 관련 미생물군의 효과 평가.
(A) RNAscope-CISH 이미지는 종양 조직에서 F. nucleatum(진한 빨간색) 및 기타 박테리아 군집(eubacteria 프로브: 청록색)의 분포를 보여줍니다. 순차적 면역조직화학 이미지는 종양 조직에서 각각 면역 및 상피 구획을 식별하기 위한 CD45+(적색) 및 PanCK+(녹색) 세포의 분포를 보여줍니다. 삽입된 이미지는 박테리아 및 해당 UV 노출 영역에 대해 양성 및 음성인 대표적인 AOI를 나타냅니다.
(B) 8개의 OSCC(왼쪽) 및 10개의 CRC(오른쪽) 종양 표본에서 박테리아 양성 AOI 및 박테리아 음성 AOI의 단백질 발현 프로필을 비교하는 DSP 데이터의 Volcano 플롯(미세 틈새 수준 분석이라고 함). 면역(CD45+), 상피(PanCK+) 또는 결합(모든 AOI) 세그먼트 데이터에서 박테리아 상태를 기반으로 한 AOI 비교 분석이 표시됩니다. 그룹당 AOI의 수가 표시됩니다. 점선은 선형 혼합 효과 모델(LMM) 분석 및 Benjamini-Hochberg 다중 보정 테스트 후 -log10(P) ≥ 1.301로 log2 변환 배수 변화 ≥ 0.58 및 ≤ -0.58로 정의되는 중요한 유전자 발현의 임계값을 나타냅니다. p 접두사는 인산화를 나타냅니다. ERK1/2는 ERK1 및 ERK2를 의미합니다. PR, 프로게스테론 수용체.
Fig 3. 숙주 단일 세포의 transcriptomics에 대한 세포 관련 종양 내 박테리아의 영향.
(A) RNAscope-FISH(왼쪽)는 OSCC 환자의 종양에서 종양 내 박테리아의 분포를 보여줍니다. 공초점 이미지(오른쪽)는 조직 해리 후 박테리아 관련 단일 세포를 보여줍니다. 눈금 막대, 1mm(왼쪽); 5μm(오른쪽).
(B) INVADEseq 방법을 사용하여 7명의 OSCC 환자로부터 종양 scRNA-seq 데이터를 통합한 후 속 수준의 마이크로바이옴 구성.
(C) UMAP 플롯은 표시된 바와 같이 7명의 OSCC 환자로부터 통합된 종양 단일 세포 데이터에서 총 박테리아 및 푸소박테리움- 및 트레포네마-연관 세포로부터의 숙주 세포 주석 및 박테리아 전사체(UMI)를 나타낸다. 색상 막대는 표시된 대로 총 박테리아 및 각 박테리아 종에 대한 박테리아 UMI 전사체를 나타냅니다. DC, 수지상 세포; MSC, 중간엽 줄기세포; Treg 세포, 조절 T 세포.
(D) ≥3 Fusobacterium UMI(High Fuso) 또는 ≥3 Treponema UMI(High Trep) 전사물 대 (vs) 총 박테리아 음성 세포(Total Bac-)를 포함하는 세포에서 차별적으로 조절되는 신호 전달 경로를 보여주는 GSEA 분석 상피 세포 클러스터.
(E) d에 기술된 세포 집단 사이에서 차등적으로 발현된 유전자를 보여주는 Volcano 플롯. 파선은 유의한 유전자 발현의 임계값을 나타내며, log2-변환 배수 변화 ≤ -0.58 및 ≥ 0.58, -log10(P) ≥ 1.301로 정의됩니다.
(F) 단핵구 유래 대식세포-v1 세포 클러스터에서 총 Fusobacterium(Total Fuso+) 또는 총 Treponema(Total Trep+) 관련 세포 대 박테리아 음성 세포(Total Bac-) 사이에서 차등적으로 조절되는 신호 전달 경로를 보여주는 GSEA 분석.
(G) f에 기술된 세포 집단 사이에서 차등적으로 발현된 유전자를 보여주는 Volcano 플롯. 파선은 유의한 유전자 발현의 임계값을 나타내며, log2-변환 배수 변화 ≤ -0.58 및 ≥ 0.58, -log10(P) ≥ 1.301로 정의됩니다.
Fig 4. F. nucleatum은 호중구 집단과 암 상피 세포의 이동을 유도합니다.
(A) F. nucleatum이 없거나(왼쪽) 또는 (오른쪽) 있는 CRC 스페로이드와 관련된 호중구 움직임을 보여주는 라이브 셀 공초점 이미징. 색상 막대는 호중구 클러스터 부피(µm3)를 나타냅니다. 스케일 바, 100μm.
(B, C) 처리되지 않은 대조군(라일락) 및 F. nucleatum 처리된(적색) 회전 타원체 내부로 이동하는 호중구의 평균 속도(b) 및 세포 변위(c). 빨간색 막대는 평균을 나타냅니다. 데이터 포인트는 개별 트랙을 나타냅니다. n은 조건당 트랙 수를 나타냅니다. 세 가지 독립적인 실험. Mann-Whitney 검정으로 계산된 P 값.
(D) 호중구 세포 궤적 플롯.
(E) 왼쪽, 초기 부피(T = 0h)에 비해 호중구 클러스터의 시간 경과에 따른 부피의 log10 변환된 배수 변화. 데이터 포인트는 조건당 시점당 평균 볼륨을 나타냅니다. 오른쪽, 볼륨의 접기 변화에 대한 곡선 아래 영역의 정량화.
(F) 19시간 동안 F. nucleatum 없이(왼쪽) 또는 (오른쪽) HCT116 회전 타원체 침입 능력의 공초점 현미경. 삽입 이미지는 마이그레이션 모드의 차이점을 나타냅니다. 스케일 바, 100μm.
(G)감염되지 않은 CRC 스페로이드의 팽창률을 나타내는 log10 변환된 시간 경과에 따른 부피 변화. 오류 막대, SD
(H) 시간이 지남에 따라 회전 타원체에서 분리되는 F. nucleatum 양성 단일 암 세포의 수. 오류 막대, SD
(I, J) F. nucleatum에 감염된 회전 타원체를 탈출하는 단일 세포의 평균 속도(i) 및 세포 변위(j). 빨간색 막대는 평균을 나타냅니다. 데이터 포인트는 개별 트랙을 나타냅니다. n은 조건당 트랙 수를 나타냅니다. 세 가지 독립적인 실험.
(K) F. nucleatum에 감염된 회전 타원체를 탈출하는 침입 암세포의 세포 궤적.
(L) 감염되지 않은 대조군과 비교하여 F. nucleatum에 감염된 CRC 스페로이드의 신호 경로 분석. DGS(Directed Global Significance) 점수는 유전자 세트의 유전자에 대한 평균 제곱 t-통계량의 제곱근으로 계산되었습니다. ECM, 세포외 기질.
(M) 감염되지 않은 대조군과 비교하여 F. nucleatum에 감염된 회전 타원체에서 선택된 경로에 대한 차등 유전자 발현의 화산 플롯. 점선은 LMM 분석 및 Benjamini-Hochberg 다중 교정 테스트 후 log2 변환 배수 변화 ≤ -0.58 및 ≥ 0.58 및 -log10(P) ≥ 1.301로 정의되는 유의 임계값을 나타냅니다.
Discussion
역사적으로 종양 이질성은 클론 확장 동안 암세포의 본질적인 유전적 변화에만 기인했습니다. 1990년대 연구에서는 TME에서 파생된 외인성 요인이 종양 형성에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌습니다. 암세포와 TME에서 섬유아세포, 내피세포, 면역 세포와 같은 다른 비악성 세포 집단 사이의 세포간 상호작용은 암이 진화함에 따라 형질전환된 세포에서 전사체 변화를 촉진함으로써 종양 이질성에 기여하는 것으로 알려져 있습니다. TME에 대한 우리의 이해가 발전함에 따라 무엇이 종양 이질성에 영향을 미치는지에 대한 이해도 발전해왔습니다. 유전체학 기반 연구에 따르면 대부분의 주요 유형의 인간 암에는 종양 내 미생물이 포함되어 있습니다. 이러한 미생물 군집은 암 유형에 따라 다르며 특정 박테리아가 암의 시작 및 진행에 기여하고 치료에 대한 환자의 반응에 영향을 미치므로 생존에 영향을 미칠 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 존재하는 본질적인 이질성으로 인해 고유 조직 컨텍스트 내에서 박테리아-숙주 상호 작용을 포함하여 TME의 서로 다른 구성 요소 간의 상호 작용을 이해하기가 어렵습니다. 공간 전사체학 및 scRNA-seq 기술의 발달로 TME의 진핵생물 구성요소를 연구할 수 있게 되었지만 TME에서 종양 내 미생물군의 효과는 지금까지 간과되어 왔습니다.
이 연구에서 이러한 기술을 채택하고 적용함으로써 우리는 종양 내 미생물군이 인간 종양 전체에 이질적으로 분포되어 있다는 결론을 내립니다. 또한, 항 종양 면역 및 암 상피 세포의 이동에 영향을 미치는 별개의 세포 구획에 대한 생물학적인 특징을 변경할 수 있는 것이 TME의 기본 구성 요소임을 보여줍니다. JUN, FOS 계열의 전사 인자를 활성화함으로써 세포내 박테리아는 암세포 침입, 전이, DNA 손상 복구, 세포 휴면과 일치하는 유전자 특징을 생성할 수 있습니다. 마찬가지로 침습성 박테리아는 JAK-STAT 신호를 통해 염증 반응을 유도하기 위해 골수 세포를 호출하고 특정 interleukins과 chemokines을 주변 환경으로 분비하여 T 세포 배제와 종양 성장을 촉진합니다. 우리는 여기에서 위장관의 양극단에 있는 두 가지 암 유형에 초점을 맞추었지만, 우리가 설명하는 도구와 기술은 지금까지 종양 내 미생물군을 포함하는 것으로 나타난 33가지 주요 암 유형을 분석하는 데 적용될 수 있습니다. 미생물군과 인간 암의 상관관계를 넘어 종양 내 미생물군의 기능적 효과를 평가하는 분석은 이러한 암의 예방 및 치료를 위한 분자 표적, 세포 표적을 식별할 것입니다. 이 연구는 환자 종양 내 종양 내 미생물군의 분포가 무작위적이지 않고 오히려 미생물군이 암 진행을 지원하는 면역 및 상피 세포 기능을 가진 microniches로 고도로 조직화되어 있음을 보여줍니다.