기억 유도 운동의 기초가 되는 뇌 전반의 신경활동
Abstract
행동은 뇌 전반에 걸친 구조화된 신경 회로의 활동에 기반을 두고 있지만, 대부분의 실험은 한 번에 한 영역의 뉴런만을 탐색해왔습니다. 여러 Neuropixels probes를 사용하여 기억유도 방향 기반의 핥기(오른쪽 핥기 또는 왼쪽 핥기)를 조정하는 회로의 한 지점인 전방 측면 운동 피질 (Anterior lateral motor cortex, ALM)과 연결된 다양한 영역의 회로에서 뇌 활동을 기록했습니다. 감각 자극, 선택 및 행동에 대한 정보를 받는 뉴런들이 뇌 전역에 분포되어 있는 것을 확인하였습니다. 그럼에도 불구하고, 선택에 관한 정보는 ALM과 ALM으로부터 ALM 의존적 방식으로 입력을 받는 하부 피질 영역(subcortical areas)에서 집중적으로 나타났습니다. 다양한 구강 안면 움직임은 후뇌(hindbrain); 중뇌(midbrain); 그리고 적은 영역의 전뇌(forebrain)에서 다루어지고 있었습니다. 선택과 관련된 신호는 먼저 ALM과 중뇌에서 감지되었고, 시상 (subcortical areas)및 기타 뇌 영역이 그 뒤를 이었습니다. 행동을 개시하는 시점에서 뇌의 전반적인 영역에서는 선택을 하기 위한 활동이 사라지고, 구체적인 행동으로 유도하는 새로운 활동 패턴이 나타났습니다. 본 실험은 의사결정과 행동 개시까지의 과정을 이해하기 위한 신경 회로 모델 개발의 기초를 제공합니다.
Figures
Anatomy-guided recordings of multi-regional neural activity
– 쥐의 기억 유도에 기반한 행동을 수행하는 동안 이루어지는 전반적인 premotor 네트워크 간의 뉴런활동을 측정함.
Fig. 1. human naive and primed reprogramming 동안 DNA methylation change의 뚜렷한 trajectories.
(A) 기억 유도에 의한 방향성 핣기(오른쪽 또는 왼쪽방향).
(B) 실험쥐의 ALM 영역부분의 전기생리학적 측정.
(C) 쥐의 세가지 주요 부분(코, 혀, 터) 이미지.
(D) ALM과 연결된 주요 뇌 영역들
(E) 212개의 뉴런으로 재구성된 ALM의 수평도.
(F) 중뇌(그룹 4)의 여러 핵을 덮고 있는 단면도 예시.
(G) Allen Reference Atlas (ARA)에 표시된 Oblique section (F) 및 해당 ALM projection density map. 전극 경로(빨간색)는 SC, MRN, 및 SNr을 포함한 ALM 투사 영역을 관통함
(H) 실험 예시.
(I) Spike raster 의 실험 예시.
(J) 엄격한 품질관리를 거친 데이터셋 요약으로 뇌 부위별로 구분되어 있음.
(K) 스파이크 비율, 폭 (정점에서 골까지의 시간), 그리고 간격 (ISI)의 변동 계수 (CV)에 대한 요약.
[Fig 1A] 실험쥐는 샘플 epoch (S)에서 청각 자극(고음/저음)에 의해 지시된 두가지 방향의 핥기 중 한 방향을 핥도록 훈련됨. 실험쥐는 지연 epoch (D)후, 응답 epoch (R)에서 “GO” 지시를 받고 반응함.
[Fig 1B] 본 연구의 전기생리학적 측정에는 실험쥐의 ALM 영역의 고속 비디오 촬영 및 레이저 기반 ALM 광저해 과정 포함하고 있음.
[Fig 1D]. ALM에 연결된 주요 뇌 영역들은 다음과 같음: 이소피질 (ALMc: 반대편 ALM, Ctx: cortex;초록 영역), 선조체 (Str; cyan), globus pallidus/pallidum (GP; 연한 하늘색), 시상 (Thal; 빨간색), 중뇌(SCm, 상부 colliculus의 운동영역; MRN, 중뇌 망상 핵; SNr, 흑질 pars reticulata; 자홍색), 교핵(PN; 주황색), 소뇌(Cb;노란색) 및 뇌수 (Med; 분홍색). 화살표 머리는 자극 연결 방향을 의미함. 원: 억제성 연결을 의미함.
[Fig 1E] 수평도에 나타난 ALM에 존재하는 212개의 뉴런은 ALM 투영 영역을 정의하는데 사용됨. 검은 점은 soma의 위치를 나타냄. 회색 점선은 오른쪽에 표시된 횡단면을 나타냄. 4개의 횡단면의 투영 밀도는 삽입그룹 1-4의 타켓에 대략적으로 대응함. AP: bregma에 대한 전후 위치. Voxel intensity는 ALM의 국소 축삭 밀도로 정규화된 축삭 투사 길이-밀도를 의미함.
[Fig 1F] 빨간선은 전극 트랙을 나타냄.
[Fig 1G] Allen Reference Atlas (ARA)와 해당 ALM 투사 밀도 맵에 표시된 경사 절면(from F). 계획된 전극 경로(빨간색)는 SC, MRN, 및 SNr을 포함한 ALM 투사 영역을 관통함.
[Fig 1H] 실험 예시. 단일 shank probe는 왼쪽 전두 피질, 왼쪽 중뇌, 오른쪽 뇌수를 타깃으로 하고, 한 개의 4-shank probe은 왼쪽 시상부를 타깃으로 함 (각각 그룹 1, 4, 5, 3에 해당함; 본문 참조). 아래쪽은 기록 위치를 나타냄. 뉴런은 뇌의 영역별로 색상을 통해 구분됨 (ARA color scheme).
[Fig 1I] 한 시험에 대한 스파이크 래스터(위의 H에 해당). 점선 회색선은 샘플 기간을, 실선 회색선은 “Go” 신호를 나타냄. 아래쪽 추적은 (C)에서 표시된 주요 포인트의 등쪽–배쪽 축을 따라 픽셀(px) 단위로 이동함.
[Fig 1J] 660회의 침투, 173회의 행동 세션, 그리고 28마리의 쥐에 대한 종합 데이터. 괄호 안의 숫자는 각 뇌 부위에서의 뉴런 수를 나타냄.
Widely distributed selective neurons
– hiPS 세포는 hES 세포와 비교하여 somatic cell epigenetic memory 또는 후천적 비정상 methylation states로 분류될 수 있는 differentially methylated regions (DMR)을 특징으로 하며, 이는 origin 또는 hES 세포에는 존재하지 않는 hiPS 세포 고유의 methylation 상태.
– hiPS 세포와 hES 세포 간의 DNA methylation 차이에 대한 보고에도 불구하고, reprogramming 동안의 temporal dynamics는 잘 알려져 있지 않음.
Fig. 2. 비정상적인 CG DNA methylation은 primed reprogramming 13일 이후에 획득되며 naive-hiPS 세포에는 존재하지 않습니다.
(A) 왼쪽, 선택성을 계산하기 위한 타임라인: 청각 자극의 첫 0.6초, 지연 시기의 마지막 0.6초, Go신호 후 첫 0.6초, Go신호 후 2-3초, 핥기 종료 후. 오른쪽, 자극 (왼쪽, 오른쪽)과 선택 (핥기 방향, 왼쪽 vs. 오른쪽)에 기반하여 네 가지 유형으로 나뉨.
(B-E) 상단, 자극 선택성은 감각자극을 기준으로 그룹화된 평균 스파이크 속도의 차이임. 하단, 자극에 대한 시간 히스토그램. 색깔은 (A)를 기반으로 정의됨. 하단, 작업변수에 따른 자극받은 뉴런들 분포 및 세기 (원 크기 및 색상은 -log(p)에 비례함). C: ALM의 선택 뉴런들의 예시, D: 연수의 반응 뉴런들의 예시, E: 중뇌의 결과 뉴런들의 예시
(F) 주요 뇌 영역에 걸친 선택적 뉴런의 비율. 괄호 안의 숫자는 각 뇌 영역에 기록된 뉴런 개수.
[Fig 2A] 해당 실험에서 진행된 behavioral test에 사용된 task variable에는 감각 자극(높은 음 vs. 낮은 음), 선택 (왼쪽 vs 오른쪽으로 핥을지 결정), 행동(Go 신호 후 행동), 결과 (보상 vs미보상) 이 있음.
[Fig 2B-E] 각task variable에 대해 뇌 영역에 걸쳐 발생률은 다르나 선택적 뉴런이 널리 분포되어 있음.
[Fig 2F] Pallidum은 선조체 및 시상으로부터 유전되었을 가능성이 있는 선택에 관련된 뉴런들의 활동의 높은 비율을 보여줌. 해마 및 후각 영역과 같은 ALM 네트워크 외의 영영에서는 선택 관련 활동이 거의 없었음.
Neural coding of movement
– 쥐들의 자극에 의한 반응을 행동으로 나타내는 비디오를 통해 뇌에 있는 개별 뉴런들의 자극 속도를 예측하는 통계 모델을 구축함. 이를 통해 쥐의 행동 및 움직임에 대한 신경반응을 코딩화하여 정량화함. 결정계수 (R2)가 움직임의 신경반응의 강도를 수치화할 때 사용함.
Fig. 3. 움직임의 신경부호화
(A) Convolution autoencoder를 사용한embedding 기반 분석에 기반한 행동 분석 비디오 자료.
(B) 연수 (Medulla)의 뉴런의 자극을 신호로 encoding하여 그래프로 나타냄. 검은색: 연수 뉴런의 자극 스파이크, 핑크색: embedding으로부터 예측된 스파이크.
(C) 행동에 대한 뉴런의 자극을 신호로 encoding한 것에 대한 spatial map. 색상 및 점 크기는 결정계수 (R2)를 나타냄.
(D) 행동에 대한 뉴런의 자극을 신호로 encoding한 것의 이미지화. 각 voxel의 색상은 300 μm 복셀의 평균 R2를 나타냄. 강조 표시된 뇌 영역은 (왼쪽 위에서 시계 방향): ALM, 시상, 선조체 및 중뇌. 점선은 관심 영역의 경계를 나타냄 (본문 내용 참조).
(E) 선택에 대한 비디오 기반 예측 행동 (AUC)을 빼기 전 (왼쪽) 과 후 (오른쪽). 뺀 후의 AUC의 대폭 감소를 확인할 수 있음. 아래 그림은 ALM 뉴런에 대한 소폭 감소. 그래프 선은 평균 스파이크 속도를 나타냄. 음영은 SEM.
(F) 샘플 epoch (왼쪽)과 delay epoch (오른쪽) 시기 동안 선택에 대한 디코딩 가능성에 대한 비디오 기반 예측치를 뺀 후의 효과. 각 점은 ALM의 뉴런에 해당함. 빼기 전 AUC가 0.6이상인 뉴런만 표시됨.
[Fig 3A] 쥐의 행동에 대해 녹화된 비디오를 분석하기 위해 비지도(unsupervised) 및 지도(supervised) 방법 모두 사용하였고 일관된 결과를 얻음. 비지도 학습으로는 convolutional autoencoder를 사용한 embedding기법, 지도 학습으로는Figure1C참조.
[Fig 3B] Embedding기반으로 분석된 뉴런의 자극 속도를 예측한 결과임.
[Fig 3C] 데이터는 뇌 전반에 걸쳐 운동 인코딩의 정도를 드러냈으며, 가장 높은 인코딩은 뇌의 주변부(periphery)에 가장 가까운 곳에서 나타났음.
[Fig 3D] ALM에서 안쪽 피질층이 표면층에 비해 더 높은 encoding신호를 나타냄.
[Fig 3E] ROC아래 영역 (AUC >0.6)으로 측정된 선택관련ALM뉴런 중, 움직임에서 예측된 신경활동을 제외한 후 선택성을 잃은 뉴런이 있는 반면, 다른 뉴런들은 선택성을 유지하기도 했음. 이와 같이 움직임과 독립적으로 선택에만 관련된 뉴런이 존재함을 알 수 있음.
[Fig 3F] ROC아래 영역 (AUC >0.6)으로 측정된 선택관련ALM뉴들에서 움직임에 의해 예측된 R2은 0과 유의미하게 다르지 않았음을 보여줌. 예를 들어. Delay epoch에 801개의 뉴런은 0.6보다 큰 AUC를 가지고 있었으나, 이중 283개의 뉴런은 예측이 미미했음 (R2<0.02). 다른 ALM뉴런의 경우, 움직임 예측을 제외한 후 AUC가 감소하여, 기준값 아래로 떨어진 뉴런이 157개였음. 따라서 예측적 움직임의 인코딩은 ALM내에서 서로 섞여 있는 개별 뉴런들 사이에서 다양함을 알 수 있음.
Encoding of choice in ALM projection zones
ALM 내에서는 선택적 뉴런들이 그라데이션을 따라 배열되어, 선택적인 높은 곳은 중앙부에, 낮은 곳은 외측에 위치함을 확인함. 해당 연구는 ALM 뉴런을 중앙 (중앙선까지의 거리 < 1.5 mm; n = 163)과 외측 (≥1.5 mm; n = 49) 하위 영역으로 나누고 해당하는 ALM 투사 구역을 정의함. 또한, 중앙 ALM에서의 투사와 관련하여 선택성의 공간 분포를 측정함.
Fig. 4. Encoding of choice in ALM projection zones.
(A) 왼쪽, 회색 음영: (A) 및 (B)에서 사용된 시상을 통한 관상 단면 (AP -1.4 ~ -1.8). 중간, 기록된 뉴런. 오른쪽, 중간 ALM 투영 밀도, ALM에서 축삭 밀도의 국소 최대치로 정규화됨. 파선, 윤곽선 90% 피크 밀도.
(B) 왼쪽, 시상의 선택성 뉴런의 분포. 빨간색 원, 핥기-왼쪽 선택성. 파란색 원, 핥기-오른쪽 선택성. 중간, 선택-selective 뉴런 (Mann-Whitney U test, p < 0.05). 오른쪽, 선택-selective 뉴런의 비율 (3D 가우시안으로 smoot 처리, 시그마 = 150 μm).
(C) 시상, 선조체 및 중뇌의 선택적 뉴런의 중위수 ALM 투영 밀도의 함수 비율. 각 피질하 영역에서 뉴런은 중위수 ALM 투영 밀도와의 중첩을 기준으로 4개의 사분위수 (x축: Q1–Q4)로 분할됨. 회색 음영, 이항 분포에 기초한 95% 신뢰 구간. 자세한 내용은 그림 S4를 참조.
[Fig 4A,B,C] 쥐의 시상과 선조체에서, ALM에 의해 밀집적으로 신경접합된 하위 영역들은 선택적 활동을 하는 뉴런들로 풍부함
ALM drives mesoscale choice activity
– 해당 연구는 ALM이 일시적으로 (0.5초) 광저해(photoinhibition)에 의해 후기 지연 epoch에서 비활성화된 실험과 대조 실험에서의 활동 및 선택성을 비교함으로써, 이러한 피질하 하위 영역에 대한 ALM의 영향을 조사함.
– 광저해는 ALM 전체의 활동을 대조 활동의 7.7% ± 0.3%로 감소시킴을 확인함.
Fig. 5. ALM은 선택활동을 유도합니다.
(A) 왼쪽, delay epoch의 마지막 0.5초 동안 전달된 ALM의 광저해 개요도. 오른쪽, 예를 들어, 대조 시험(상단 행)과 ipsi-ALM 광저해 시험(하단 행) 중 ALM, 시상(중앙후핵), 선조체(미주신경핵), 중뇌(상대구)의 뉴런에 대한 PSTH들. 파란색은 correct contra-trials, 빨간색은 ipsi-ALM광저해 시험을 나타냄. 음영은 SEM. 수직 파선은 behavioral epoch을 나타냄.
(B) 대조 시험에서 delay epoch의 선택적 활동과 ipsi-ALM 광억제 시작 후 개별 뉴런의 스파이크 속도 변화 사이의 관계. 점선은 증가 그룹(빨간색)과 감소 그룹(파란색)에 대한 선형 회귀를 나타냅니다(r은 피어슨 상관 계수, ***p < 0.001; bootstrapping은 계수가 0이라는 귀무가설을 기각). 삽입 그림은 조절된(검은색 막대, 만-휘트니 U 검정, p < 0.05) 및 비조절 뉴런(회색 막대)의 평균 선택성을 보여줌.
(C) 대조 시험 동안의 선택성에 따른 ipsi-ALM 광억제 후 개별 뉴런의 선택성 변화 기능으로, 시상(왼쪽), 선조체(가운데), 중뇌(오른쪽)를 나타냄. 대조 중 선택성 변화를 교란에 따른 선택성 변화와 상관관계를 없애기 위해, 대조 시험을 두 그룹으로 나누었음: control 1은 대조 조건 하에서 선택성을 평가하기 위해, control 2는 비활성화 시험과 비교할 때 선택성 변화를 계산하기 위해. 색상 점들은 비활성화 중 스파이크 속도에서 유의미한 변화가 있는 뉴런들을 나타내며(Mann-Whitney U 검정, p < 0.05), 회색 점들은 비조절 뉴런들을 나타냄.
(D) 각 피질하 영역에서 ALM 투사 밀도의 함수로서 유의미하게 비활성화된 뉴런의 비율.
[Fig 5A] ALM이 일시적으로 (0.5초) 광저해(photoinhibition)에 의해 후기 지연 epoch에서 비활성화된 실험 모식도
[Fig 5B] 모든 뇌 영역에서, 뉴런의 스파이크 속도 변화 정도는 ALM 광저해 동안의 뉴런들과 대조 조건 하의 지연 선택성 뉴런들과 상관 관계가 있었음. ALM 광저해에 의해 스파이크 속도가 변하지 않은 뉴런들은 선택성이 거의 없었음.
[Fig 5C] ALM침묵 실험은 선택적인 뉴런일수록 선택성에 더 큰 변화를 초래함. 이를 통해 ALM 광저해 동안 활동 및 선택성이 크게 감소한 뉴런들은 선택 정보를 많이 담고 있음을 알 수 있음.
[Fig 5D] ALM 광저해에 의한 활동 억제는 ALM 투사 구역에서 더 두드러짐.
Emergence of choice signals across the brain
– 샘플 에포크 동안 ALM 뉴런의 활동과 선택 선택성의 변화, 그리고 시간에 따른 뉴런의 집단 선택 디코딩 정확도를 알 수 있음.
Fig. 6. 샘플 에포크 동안 ALM 뉴런의 활동과 선택 선택성의 변화, 그리고 시간에 따른 뉴런의 집단 선택 디코딩 정확도를 알 수 있습니다.
(A) 샘플 에포크에서 두 ALM 뉴런의 PSTH임. 왼쪽은 선택 선택성을 가진 뉴런, 오른쪽은 선택이 아닌 시도 유형에 대한 선택성을 가진 뉴런임. 상단은 각 시도 그룹에서 자극 선택(LL, RR, LR, RL; 그림 2A 참조)에 따라 레이블된 평균 PSTH를 나타냄. 음영은 SEM을 나타냄. 하단은 d’로 계산된 선택 선택성을 보여줌.
(B) 단일 뉴런 선택 선택성 분포(d’, 가로축)임. 주황색은 샘플 이전 에포크(−2.1초), 보라색은 샘플 중간 에포크(−1.65초), 녹색은 샘플 에포크 끝(−1.2초)을 나타냄. 점선은 셔플된 시도 ID로 생성됨. 삽입된 그림은 다른 시간 지점에서 높은 선택 선택성(d’ > 0.6)을 가진 뉴런의 수를 실제 데이터와 셔플된 시도 ID 데이터로 보여줌.
(C) 시간에 따른 높은 선택 선택성(d’ > 0.6)을 가진 뉴런의 비율임. 중앙에 색칠되지 않은 원은 shuffle된 trial ID로 계산됨.
(D) 시간에 따른 집단 선택 디코딩임. 모든 영역의 SEM은 0.10 이내임. 상단의 막대는 부트스트래핑 반복의 최소 95%에서 두뇌 영역의 디코딩 정확도가 0.5보다 큰 시간을 나타냄.
Correlated encoding across brain areas
Fig. 7. 뇌 영역 전반에 걸친 상관관계.
(A) 왼쪽, 코딩 방향 (CD) 정의. 오른쪽, 한 동작 세션에서의 CDchoice에 대한 ALM 인구 활동 평균 투영(pCDchoice) (음영, 표준 편차).(B) 네 개 뇌 영역 (양측 ALM 및 양측 뇌간)의 동시 기록 활동, lick-right 및 lick-left 시행에서 각각의 선택 CD에 투영. 시간 구간은 200ms.
(C) 왼쪽, 두 뇌 영역 (왼쪽 ALM, 왼쪽 thalamus)에서 늦은 지연 구간 ([−0.6, 0] s) 동안의 pCD choice 상관관계 (예시 세션; 올바른 시행). 오른쪽, 다양한 시간 구간 (200ms 단위)에서 계산된 왼쪽 ALM-왼쪽 thalamus 쌍의 pCDchoice에대한 순위 상관관계 (n = 32 세션). CDchoice는 전체 지연 구간에서 계산됨. 세션별 평균 ± SEM.
(D) (C)와 동일 데이터, 이제 CD stimulus 및 CDaction에 투영됨.
(E) 다양한 CD에서 다섯 뇌 영역 간의 기능적 연결성, 순위 상관관계로 측정됨. 색상 원은 뇌 영역을 나타냄. 뇌 영역을 연결하는 선의 너비는 순위 상관관계에 비례함. 왼쪽은 ALM을 중심으로, 오른쪽은 반구 간. 실선은 직접 해부적 경로를 나타내며, 점선은 약한 또는 부재하는 경로를 나타냄.
Disscussion
해당 연구는 쥐의 기억 유도 움직임 과정 동안 연결된 운동 전 네트워크에서 신경 활동을 측정했습니다. 행동과 관련된 신경 활동은 널리 분포되어 있었지만 균일하지는 않았음을 확인했고 선택과 관련된 활동은 다중 영역 루프에 집중되어있었습니다. 처음에는 ALM에서 감지되었고, 피질하 영역의 신호는 ALM 입력과 관련이 있었습니다. 활동 패턴은 움직임 시작과 일치하면서 뇌 영역에 걸쳐 강한 상관관계를 보였습니다. 이를 통해 본 연구는 정밀한 해부학적 측정을 사용했고 다중 영역 연결성의 복잡성을 강조했습니다.