수용체 분해를 위한 E3 ubiquitin ligase의 항체 표적화
Abstract
현대 치료법 중 원형질막 수용체를 표적으로 하는 대부분의 치료법은 ligand binding이나 효소 활성을 antagonizing 하여 기능합니다. 하지만 전형적인 포유동물의 단백질은 개별적이지만 coordinated activity를 실행하는 다중 도메인으로 구성됩니다. 따라서 한 도메인에 대한 억제는 단백질의 기능을 완전히 억제 못할 수 있습니다. 실제로 proteolysis-targeting chimeras (PROTAC)를 포함한 표적 단백질 분해 기술은 단백질을 억제하는 것보다 표적을 분해하는 것이 임상적으로 중요한 이점을 가진다는 것을 보였습니다. 그러나, 높은 친화도를 가지는 두 표적에 동시에 결합하는 heterobifunctional compound는 oral bioavailability에 적용시키기 복잡합니다. 이 연구에서 우리는 세포 표면 E3 ubiquitin ligase를 transmembrane protein에 연결하여 in vitro와 in vivo 모두에서 표적의 억제를 유도하는 proteolysis-targeting antibodies (PROTAB)의 개발을 보였습니다. 우리는 Wnt-responsive ligase인 zinc- and ring finger 3 (ZNRF3)에 초점을 맞춘 접근법이 대장암 특이적 분해를 가능하게 할 수 있음을 보였습니다. 특히, additional cell-surface E3 ubiquitin ligase와 transmembrane receptor의 matrix를 확인하여 이 기술이 ‘on-demand’ 분해에 대해 조절 가능함을 보여줍니다. 또한 최적화된 antibody format을 engineering하여 표적의 분해를 제어하는 기본 규칙에 대한 내용을 보였습니다. 이 연구를 통해 세포 표면 단백질을 선택적으로, 강력하고 bioavailable하며 tissue-selective degrader의 신속한 개발을 위한 전략을 설명합니다.
Figures
Fig 1. Wnt-responsive E3 ubiquitin ligase인 RNF43와 ZNRF3은 IGF1R을 분해할 수 있습니다.
a, CRISPR-Cas9을 이용한 APC mutant colon organoid 제작.
b, WT과 APC mutant colon organoid에서 gene expression 비교.
c, AKPS colon organoid에서 Rnf43과 Znrf3을 probe로 사용한 in situ hybridization.
d, iDimerize construct에 대한 개략도.
e, A/C heterodimerizer로 RNF43–IGF1R iDimerize를 발현하는 HEK293T에서 IP 결과.
f, gD-based PROTAB-mediated IGF1R의 분해에 대한 개략도.
g, gD-RNF43-Flag 또는 gD-ZNRF3-Flag를 발현하는 HT29 cell에서 gD-based PROTAB 처리 후 세포 표면 IGF1R에 대한 flow cytometry 결과.
h, Parental cell, gD-RNF43-Flag 발현 cell에서 PROTAB 처리 시 IGF1β에 대한 western blot 결과.
i, Parental cell, gD-ZNRF3-Flag 발현 cell에서 PROTAB 처리 시 IGF1β에 대한 western blot 결과.
Fig 2. Endogenous RNF43나 ZNRF3을 IGF1R에 연결하면 표적의 internalization과 분해가 유도됩니다.
a, Ligase-based PROTAB에 의한 IGF1R 분해 개략도.
b, gD–RNF43–Flag을 발현하는 HT29 cell에서 PROTAB 처리 시 세포 표면 IGF1R에 대한 flow cytometry 결과.
c, gD–ZNRF3–Flag을 발현하는 HT29 cell에서 PROTAB 처리 시 세포 표면 IGF1R에 대한 flow cytometry 결과.
d, HiBiT-IGF1R knock-in HT29 cell에 ZNRF3*IGF1R bispecific PROTAB 처리 후 세포 표면 IGF1R의 양.
e, 다양한 colorectal cancer cell에 각 antibody를 처리했을 때 IGF1R-β의 발현 정도.
f, 각 antibody 처리 후 IGF1 처리 여부에 따른 western blot 결과.
g, 각 antibody 처리 시 SW48 cell의 viability.
h, SW48 xenograft 모델 개략도.
i, 각 antibody를 복강 내 투여 후 SW48 xenograft 상태와 정상 colon에서의 western blot 결과.
j, 각 antibody 처리 후 normal organoid와 tumour-derived organoid에서의 western blot 결과.
Fig 3. ZNRF3*IGF1R에 대한 이중특이성 PROTAB은 ligase 의존적 방식으로 표적의 분해를 유도합니다.
a, PROTAB 처리한 cell에서 IGF1R:ZNRF3의 세포 표면 비율에 대한 copy number analysis 결과.
b, 각 cell line에서 세포 표면 ZNRF3의 발현 정도.
c, WT 또는 ZNRF3 indel을 발현하는 HT29 cell에서 PROTAB 처리 후 western blot 결과.
d, SW48 cell에 DMSO 또는 E1 inhibitor인 MLN7243 처리 후 PROTAB 처리한 뒤 western blot 결과.
e, HT29 cell에 각 antibody 처리 후 IGF1Rβ로 IP하여 western blot 결과.
f, SW48 cell에 DMSO, MG132 (proteasome inhibitor), BafA1 (lysosomal pathway inhibitor)를 처리하고 PROTAB 처리 시 western blot 결과.
g, SW48 cell에 각 antibody 처리 후 quantitative proteomic analysis를 진행한 volcano plot.
h, 각 antibody를 처리한 mice intestinal tissue에서 Wnt- 관련 유전자의 transcripts level.
i, 각 antibody를 처리한 mice intestinal architecture.
Fig 4. 여러 가지 세포 표면 E3 ubiquitin ligase는 원형질막에 위치한 표적을 분해할 수 있습니다.
a, 각 antibody를 복강 내 투여한 뒤 SW48 xenograft에서 western blot 결과.
b, 각 antibody를 복강 내 투여한 뒤 SW48 xenograft에서 western blot 결과.
c, Parental cell과 gD-ligase-Flag construct를 발현하는 HT29 cell에서 세포 표면 gD epitope의 빈도.
d, 각 gD-ligase-Flag construct를 발현하는 HT29 cell에서 antibody 처리 시 western blot 결과.
e, 각 gD-ligase-Flag construct를 발현하는 ASPC1 cell에서 antibody 처리 시 세포 표면 FZD5의 양.
f, PROTAB antibody engineering과 downstream 진행 과정에 대한 개략도.
g, gD-RNF43-Flag을 발현하는 HT29 cell에 2 (ligase) + 1 (target) 조합으로 antibody 처리했을 때 세포 표면 IGF1R과 RNF43의 양을 확인한 flow cytometry 결과.
h, gD-RNF43-Flag을 발현하는 HT29 cell에 one-arm Fv–IgG 조합으로 antibody 처리했을 때 세포 표면 IGF1R과 RNF43의 양을 확인한 flow cytometry 결과.
i, gD-RNF43-Flag을 발현하는 HT29 cell에 2 (target) + 1 (ligase) and 2 (ligase) + 1 (target) 조합으로 antibody 처리했을 때 세포 표면 IGF1R과 RNF43의 양을 확인한 flow cytometry 결과.
j, 각 antibody를 처리한 DLD1 cell에서 western blot 결과.