자매 염색 분체 응집력 확립을 위한 복제 포크 결정 요인
Abstract
DNA 복제와 함께 염색체 코헤신 복합체는 새로 복제된 자매 염색 분체 사이의 응집력을 확립합니다. 결합 확립은 Eco1 아세틸트랜스퍼라제에 의한 보존된 코헤신 라이신 잔기의 아세틸화를 필요로 합니다.
이 연구에서는 코헤신 아세틸화가 어떻게 DNA 복제와 연결되는지 탐구합니다. 복제 결합 코헤신 아세틸화의 생화학적 재구성은 DNA 복제 중에 형성되는 일시적인 DNA 구조가 아세틸화 반응을 제어한다는 것을 보여줍니다. 중합효소가 지연 가닥 복제를 완료함에 따라 가닥 치환 합성은 잘린 DNA 플랩을 생성하여 이중가닥 DNA에 흠집이 나게 합니다. 플랩과 닉은 모두 코헤신 아세틸화를 자극하는 반면, 오카자키 조각 성숙을 완료하기 위한 후속 닉 결찰은 아세틸화 반응을 종료합니다. 플랩 또는 흠집이 난 DNA 기질은 코헤신이 두 자매 염색분체를 포획할 가능성이 있는 복제 분기점 뒤의 창으로 코헤신 아세틸화를 지시하는 일시적인 분자 단서를 구성합니다.
우리의 결과는 DNA 복제가 자매 염색 분체 결속 확립과 어떻게 연결되어 있는지에 대한 설명을 제공합니다.
Figure
[Figure 1] 코헤신 아세틸화의 S기 특이성
(A) Eco1의 개략도, 생존성 테스트, 웨스턴 블롯 분석 결과.
(B) 각 시기별 웨스턴 블롯 분석 결과.
[Figure 2] 복제 결합 코헤신 아세틸화의 생화학적 재구성
(A) 코헤신 및 코헤신 확립 인자의 존재 하에서 프라이밍된 ssDNA 복제 분석의 개략도와 쿠마시 블루 염색 결과.
(B) 복제 결합 코헤신 아세틸화를 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과.
(C) PIP 상자 및 징크 핑거 의존 코헤신 아세틸화와 정제된 야생형 및 돌연변이 Eco1의 쿠마시 블루 염색 결과.
[Figure 3] DNA 합성 완료 후 코헤신 아세틸화
(A) Pol δ를 사용한 프라이머 확장 반응에서 DNA 복제 산물의 겔 이미지 및 표시된 구성 요소를 생략한 반응에서 Smc3 아세틸화의 웨스턴 블롯 분석 결과.
(B) Pol ε 매개 프라이머 확장 반응에 코헤신 및 코헤신 확립 요인이 추가된 시간 간격을 나타내는 실험의 개략도. Smc3 아세틸화의 웨스턴 블롯 분석 결과와 인큐베이션 동안 표시된 시점에서 DNA 복제 산물의 겔 이미지.
[Figure 4] 완전히 복제된 DNA의 PCNA는 코헤신 아세틸화를 자극합니다.
(A) PCNA 및 코헤신 아세틸화의 겔 이미지와 웨스턴 블롯 분석 결과.
(B) Ctf18-RFC, Rfc1-RFC 및 PCNA를 고정화되고 부분적으로 복제된 DNA 기질에 로딩하는 PCNA에 대한 웨스턴 블롯과 겔 이미지.
[Figure 5] DNA 닉 또는 플랩은 코헤신 아세틸화를 촉진합니다.
(A) PCNA 로딩 및 코헤신 아세틸화 반응 후 이들 기질의 겔 이미지와 사용된 고정된 DNA 기질의 개략도.
(B) (A)와 같지만, 63nt 갭 기판은 올리고 결찰에 의해 추가로 변형되어 닉을 재현하거나, 플랩을 생성하거나, DNA를 공유적으로 닫은 닉 DNA 기질을 사용하여 관찰된 수준에 상대적으로 플롯한 결과.
[Figure 6] 코헤신 아세틸화를 종결시키는 닉 라이게이션
(A) Fen1 플랩 엔도뉴클레아제 및 Cdc9 리가아제의 부재 또는 존재에서 Pol δ에 의한 프라이밍된 ssDNA 복제의 개략도. 반응 분취량의 복제 산물에 대한 겔 전기영동과 Eco1을 20분 더 추가하고 Smc3 아세틸화에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과.
(B) PCNA 로딩 및 Smc3 아세틸화에 대한 전체 단백질 분획 옆의 웨스턴 블롯 분석 결과와 복제 산물을 겔 전기영동 이미지.
[Figure 7] Scc2, Scc4 및 Pds5는 함께 Smc3 아세틸화를 촉진합니다.
(A) 비드 결합, 프라이밍된 ssDNA 기질을 사용한 복제 결합 코헤신 아세틸화 반응의 개략도. 유리 및 비드 결합 분획의 겔 이미지 및 웨스턴 블롯 분석 결과.
(B) Scc4는 효율적인 코헤신 아세틸화에 대한 겔 이미지와 웨스턴 블롯 분석 결과.
(C) DNA 복제 분기점에서 자매 염색분체 결속 확립을 위한 모델.
Disscussion
코헤신의 자매 염색분체 포용을 안정화시키는 복제 결합 코헤신 아세틸화는 진핵생물 자매 염색분체 응집 확립의 특징입니다. 여기에서 우리는 복제 결합 코헤신 아세틸화를 조사하기 위해 생화학적 분석법을 개발했습니다. 이 접근법은 오카자키 단편 성숙 동안 일시적으로 형성되는 DNA 구조 (플랩 및 닉)를 코헤신 아세틸화를 제어하는 분자 결정 요인으로 식별했습니다. 아세틸화 신호의 특성을 알면 DNA 복제 분기점에서 자매 염색분체 결합의 확립을 위한 모델을 구축할 수 있습니다.