인체 SARS-CoV-2 감염 모델을 통해 국소 및 전신 면역 반응 역학을 밝히다
![[EzV] Human SARS-CoV-2 Challenge Uncovers Local and Systemic Response Dynamics](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2024/07/EzV-Human-SARS-CoV-2-Challenge-Uncovers-Local-and-Systemic-Response-Dynamics.png)
Abstract
COVID-19 팬데믹은 여전히 지속 중이며 위협적이지만, 이 질병에 대한 초기 세포 반응의 역학에 대한 이해는 제한적입니다.
이 연구에서는 SARS-CoV-2 human challenge model*을 통해 혈청 음성인 참가자들에게 Alpha 변이 이전의 SARS-CoV-2를 노출시켰습니다. 비인두(nasopharyngeal) 면봉과 혈액 샘플의 single-cell multi-omics profiling을 사용하여 중단된 감염(abortive infection), 일시적 감염(transient infection), 지속적 감염(sustained infection)*의 경우를 각각 시간에 따라 분석했습니다.
분석 결과, 특정 시점과 감염 상태에 따라 상피 세포와 면역 세포의 세포 유형 비율과 수십 개의 동적인 세포 반응 상태가 빠르게 변화하는 것을 발견했습니다. 감염 후, 혈액을 도는 인터페론(interferon) 반응이 비인두 반응보다 앞서 발생하는 것을 관찰했습니다. 또한, 비인두 면역 세포 침투는 일시적 감염에서는 초기에 발생했으나, 지속적 감염에서는 일정 시간 후 발생했습니다. 접종 전에 HLA-DQA2가 높게 발현된 경우, 지속적인 감염에 대한 예방 효과와 관련이 있었습니다. 섬모 세포(ciliated cells)는 다양한 면역 반응을 보였고 바이러스 복제에 가장 취약했지만, 비인두 T 세포와 대식세포는 감염 시 바이러스 복제가 효율적으로 일어나지 않았습니다. 연구진들은 54개의 T 세포 상태를 분석했으며, 여기에는 SARS-CoV-2 motifs를 가지고 클론으로 확장된 급성 활성화 T 세포가 포함되었습니다. 연구진들이 새로 개발한 파이프라인 Cell2TCR은 유전자 발현 신호를 기반으로 활성화된 항원 반응 T 세포를 식별하고 이를 클론형 그룹과 motif로 clustering합니다.
종합적으로, 이 연구에서 사용하는 시계열 데이터는 상피 및 면역 세포 반응을 이해하는 데 중요한 역할을 하며, 감염에 대한 보호와 관련된 초기 동적 반응을 보여줍니다.
* human challenge model: 건강한 사람들을 특정 병원체에 고의로 노출시켜 질병의 발생과 면역 반응을 연구하는 과학적인 방법.
* Abortive Infection: 감염이 발생하지 않거나, 매우 짧은 시간 내에 감염이 중단된 상태.
* Transient Infection: 일시적인 감염 상태로, 바이러스가 체내에 오래 남지 않고 제거된 상태.
* Sustained Infection: 바이러스가 지속적으로 체내에 남아 있고, 감염이 확실히 진행된 상태.
Figures
Human SARS-CoV-2 challenge model
l Human challenge model을 수행하기 위해 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대해 음성인 젊은 성인들에게 Alpha 변이 이전의 SARS-CoV-2를 비강 내 접종하여 감염을 유도했습니다.
l 이 모델을 통해 비인두와 혈액에서 세포 반응을 시간에 따라 single cell 해상도로 분석하여, SARS-CoV-2에 대한 local & global 면역 반응을 파악합니다.
Cellular trends over time and infection & Local immune infiltration
![[Fig1] Human SARS-CoV-2 Challenge Uncovers Local and Systemic Response Dynamics](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2024/07/Fig1-Human-SARS-CoV-2-Challenge-Uncovers-Local-and-Systemic-Response-Dynamics-1024x495.png)
[Figure 1] SARS-CoV-2 접종 후 광범위한 시간에 따른 세포 상태 역학 조사
(a) Human challenge model의 연구 디자인 및 코호트 구성.
(b, c) 비인두 세포의 UMAP clustering plot. Cell-type annotation, 감염 그룹 및 바이러스 접종 후 날짜 수에 따라 다르게 색 표현.
(d, e) 모든 PBMC(말초 혈액 단핵세포)를 보여 주는 UMAP plot.
(f) 비인두에 있는 넓은 범주의 면역 세포 유형의 양적 변화를 fold 단위로 표현.
[Figure 1a] SARS-CoV-2 노출에 대해 서로 다른 감염 형태 (중단된 감염(abortive infection), 일시적 감염(transient infection), 지속적 감염(sustained infection))를 보이는 세 가지 표현형에서의 반응을 포괄적으로 식별하고, 시간에 따른 변화를 시각적으로 보여줍니다.
최대 7개의 시점에서 비인두 세포 및 PBMC를 수집하고, scRNA-seq과 single-cell TCR 및 BCR sequencing을 수행했습니다. 이렇게 181명의 환자들에게서 총 60만 개가 넘는 single-cell transcriptome을 획득하여 논문의 분석에 활용했습니다. 해당 부분에 대한 자세한 내용은 Methods의 ‘Study participants and design’ 파트에서 확인 가능합니다.
[Figure 1b, d] 비인두 및 PBMC의 전반적인 UMAP 분포 및 세포 유형을 보여줍니다. 예측 모델 및 marker gene expression을 통해 총 202가지의 세포 종류를 파악했으며, 두 종류의 UMAP에서 모두 적합한 세포 종류를 파악할 수 있었습니다.
[Figure 1c, e] 세포 종류를 고려하지 않더라도 감염 형태 및 시간에 따라 세포 종류의 분포가 달라지는 것을 확인할 수 있습니다.
[Figure 1f] Transient & Sustained infection에서 모든 면역 세포 유형이 SARS-CoV-2에 노출된 후 접종 부위에 유의하게 침투하는 것을 확인했습니다. 접종 부위에 면역 활동이 집중되는 것을 파악할 수 있습니다.
Interferon response in blood before nose ~ HLA-DQA2 predicts infection outcome
l 감염 시 발생하는 유전자 발현 및 항바이러스 반응이 감염 상태 별로 서로 어떻게 다른지 비교하여 감염에 핵심적인 유전적 요인을 찾고자 합니다.
![[Fig2] Human SARS-CoV-2 Challenge Uncovers Local and Systemic Response Dynamics](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2024/07/Fig2-Human-SARS-CoV-2-Challenge-Uncovers-Local-and-Systemic-Response-Dynamics-1024x575.png)
[Figure 2] 세포 상태 별 항바이러스 반응 및 감염 상태
(a) sustained infection 환자의 비인두 세포(왼쪽)와 PBMC(오른쪽)에서 interferon 자극 유전자의 평균 발현량.
(b) SARS-CoV-2 접종 후 시간에 따른 순환 염증 monocyte의 상대적 비율.
(c) 활성화된 순환 MAIT cell의 비율.
(d) sustained infection 사례에서 SARS-CoV-2 양성 비인두 세포 수.
(e) sustained infection 사례에서 반응 또는 감염 세포 상태로 annotation된 섬모 세포의 비율.
(f) SARS-CoV-2 양성 세포당 viral read 수.
(g) SARS-CoV-2에 감염된 human nasal epithelial culture에서 감염된 섬모 세포(왼쪽) 및 과감염된섬모 세포(오른쪽)의 전자현미경 사진.
(h) Differential expression analysis를 통해 확인한 abortive infection 및 sustained infection 사례 간 접종 전 PBMC에서의 유전자 발현.
(i) 비인두 세포에서의 HLA-DQA2 발현.
(j) PBMC에서의 HLA-DQA2 발현.
[Figure 2a: Interferon response in blood before nose]
우선 환자가 감염되었을 때 상주 조직 및 순환 세포에서 항바이러스 유전자 발현을 검출하고자 했습니다. Sustained infection 환자에서 조사한 모든 세포의 interferon 반응이 강하게 나타난다는 것을 보이며, interferon 반응 유전자가 SARS-CoV-2 감염 초기에 중요한 역할을 한다는 것을 유추할 수 있습니다. 여기에는 특히 ILC(circulating innate lymphoid cells) 및 nasopharyngeal γδ T 세포 등이 포함되며, 모든 sustained infection 환자에서 접종 후 day 3 ~ day 5에 interferon 반응을 지속적으로 확인할 수 있었습니다.
[Figure 2b: Rapid decrease in inflammatory monocytes]
지속적 감염이 있는 경우, 3일째에 순환 중인 cDC3 세포와 비인두 골수 계열 세포(다수의 dendritic cells, macrophage 및 monocyte)의 감소가 관찰되었습니다. 이후 접종 부위에서만 골수 계열 세포의 증가가 관찰되어, 초기에 순환하는 세포가 조직으로 재편성되었음을 시사합니다. 해당 figure는 이를 뒷받침하는 자료로, 염증성 monocyte가 혈액 내에서 순환하는 정도가 낮아졌음을 모든 표현형에서 확인할 수 있었습니다. (IL1B, IL6 and CXCL3 발현량으로 마킹)
[Figure 2c: MAIT(mucosal-associated invariant T) cell activation]
순환 염증성 세포처럼, 모든 감염군을 통틀어 면역 반응에 변화가 있는 세포가 있는지 탐구하고자 합니다. 이를 위해 점막 및 조직에 주로 존재하며 신속한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려진 비전통적 T세포인 MAIT cell의 활성화를 살펴봅니다. 그 결과, SARS-CoV-2 접종 3일 후 sustained infection 환자군에서 거의 모든 MAIT cell이 활성화 되었음을 확인했습니다.
[Figure 2d: Detection of viral RNA peaks at day 7]
위에서 관찰한 면역 반응이 바이러스 감염 역학에 어떻게 영향을 미치는 지 확인하기 위해 SARS-CoV-2 ssRNA genome 및 transcript에 집중했습니다. 이를 측정함으로써 감염된 세포에서 바이러스성 유전자 발현의 정도를 정량화할 수 있습니다. Sustained infection 환자의 경우, 비인두 세포에서 이러한 viral RNA가 대다수 검출되었습니다. 이러한 감염 세포는 접종 5일 후 발견되었고, 7일에 정점을 찍었다가 10-14일에 급격한 감소를 보였습니다. 특히 비인두 쪽 상피 세포 및 주변 면역 세포(CD8+ T 세포)에서 많이 발견되었습니다.
[Figure 2f, g: Hyperinfection of ciliated cells]
섬모 세포(표면에 섬모가 덮인 상피 세포의 일종)와 배상 세포(점액 분비하는 상피 세포)에서 productive viral infection이 감지된 것을 바탕으로, 바이러스 확산에 가장 큰 기여를 하는 세포를 식별하고자 했습니다. Figure 2(f)에서, 평균적으로 세포당 1,000개 이상의 바이러스 RNA를 포함하는 매우 높은 바이러스 부하를 가진 섬모 세포의 소규모 cluster가 관찰되었습니다. Figure 2(g) 에서는 전자현미경을 사용하여 실험실에서 SARS-CoV-2에 감염된 인간 비강 상피 배양 세포에서 바이러스 부하가 크게 변할 수 있음을 검증했습니다.
[Figure 2e: Ciliated cell acute-phase response]
SARS-CoV-2 감염에 대한 local response에서 섬모 세포의 역할을 추가로 조사하기 위해, 섬모 세포 구획을 기존의 섬모 상태와 4개의 별개의 동적 상태로 설명했습니다. 감염 전에는 소수의 섬모세포에서만 이 APR(acute-phase response; 면역계가 병원체를 신속히 제거하고 조직 손상을 회복하려는 반응) 반응이 나타났지만, sustained infection 참가자의 경우 감염 후 1일차에 최대 50%의 섬모세포가 APR 반응이 나타납니다.
[Figure 2h-j: HLA-DQA2 predicts infection outcome]
접종 직후 non-sustained 환자에서 확인된 잠재적인 보호 반응을 확인하여, 감염 전 발현 수준이 질병 결과를 예측할 수 있는 유전자를 식별했습니다. 바이러스 접종 전날 혈액면역세포와 비인두세포에서 HLA-DQA2 발현량이 바이러스가 지속적인 감염 형성에 성공하지 못한 참가자에서 더 높았습니다.
Identification of activated T cells ~ Cell2TCR identifies virus-specific TCRs
![[Fig3] Human SARS-CoV-2 Challenge Uncovers Local and Systemic Response Dynamics](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2024/07/Fig3-Human-SARS-CoV-2-Challenge-Uncovers-Local-and-Systemic-Response-Dynamics-1024x1015.png)
[Figure 3] 2차 면역 반응은 접종 10일 후에 발생한다
(a) 모든 감염 그룹에서 순환하는 T 세포의 UMAP 플롯으로, 활성화된 T 세포 클러스터를 굵게 표시함.
(b) 활성화된 T 세포 하위 집합의 마커 유전자와 단백질 발현.
(c) 모든 감염 그룹에서 활성화된 비인두 T 세포의 비율을 보여주는 box plot (n = 28,426 T 세포, 104개 샘플).
(d) 활성화된 T 세포 중 혈중 세포만 선정하여 그 비율을 보여주는 box plot (n = 155,058 T 세포, 77개 샘플).
(e) 모든 감염 그룹에서 비인두 T 세포의 UMAP 플롯.
(f) 지속적 감염에서 접종 전과 비교한 전통적 T 세포 상태의 변화율, 유의미한 변화가 있는 세포 상태만 표시됨.
(g) 지속적 감염 사례에서 14일째 활성화된 T 세포의 TCR 클론성 및 확장성 검증 (n = 1,988 활성화된 T 세포, 30개 샘플).
(h) 모든 TCR 중 TCR 클러스터의 상대적 풍부함, 활성화된 TCR 클러스터를 색상으로 구분하고 그들의 TCR 모티프를 보여줌.
[Figure 3a, b, e: Identification of activated T cells]
CD4+ 및 CD8+ T세포가 감염 후 어떻게 활동하는 지 알기 위해, 혈액(3a) 및 비인두(3e)에서의 T세포에 대한 annotation을 보다 정밀하게 진행했습니다. 해당 분석에 포함된 T cell들의 주요 유전자 발현 정보가 (3b)에 정리되어 있습니다.
해당 부분에서 제시하는 T cell들은 해당 연구에서 진행한 enrichment experiment를 통해 매우 세세하게 확인할 수 있었습니다.
[Figure 3c, d, f, g: Activate T cell dynamics]
활성화가 확인된 T세포의 특징을 파악하기 위해, 시간과 감염 그룹에 걸친 분포를 확인했습니다. (3c: 비인두, 3d: 혈액 내, 3f: sustained infection 환자들만 선정 + T세포 세분화)
CD4+ 및 CD8+ T cell은 각각 helper T cell 및 cytotoxic T cell으로 SARS-CoV-2 접종 10일 정도에 가장 많이 발견되었으나, 이와 반대로 면역 반응을 억제하고 자가면역 반응을 방지하는 regulatory T cell은 이보다 늦은 시점인 접종 14일 후에 정점에 도달했습니다. 이를 뒷받침하는 앞선 결과들로는 fig. 3b(항염증 작용 사이토카인 IL10 발현 증가), fig. 2a(interferon 관련 반응의 감소) 등이 있습니다.
또 하나의 특징으로 CD8+ T cell이 혈액에서 보다 장기적으로 활성화되었으며(3d), 반대로 비인두에서는 CD4+ T cell이 장기적인 활성을 보였습니다(3c). 특히 CD4+ T cell은 감염 발생지에서 매우 풍부하게 확인되었습니다.
나아가 single cell 해상도로 얻은 T cell 데이터를 고감도 대량 TCR sequencing 데이터와 통합하여, sustained infection에서 접종 7일 이후 활성화된 T 세포 관련 TCR 서열이 실제로 확장됨을 검증했습니다(3g). 반면, 중단된 감염에서는 이러한 클론 확장이 관찰되지 않았습니다.
[Figure 3h: Cell2TCR identifies virus-specific TCRs]
BCR 및 TCR의 클론형(clonotype; 특정 TCR & BCR을 가지고 있는 면역 세포의 군집) 중 SARS-CoV-2를 특이적으로 인식하는 클론형을 찾기 위해 서로 다른 B cell 및 T cell을 활용했습니다. 이는 어떤 항체가 SARS-CoV-2와 반응하는지 확인하는 데 유용합니다.
Sustained infection 환자 6명의 세포 중 항원에 특이적으로 반응하는 것으로 보이는 activated clonotype 그룹을 선택하여 해당 세포들의 항체를 채취하여, 총 20개의 활성화된 TCR clonotype 및 15개의 활성화된 BCR clonotype 그룹을 검출했습니다.
Public SARS-CoV-2-specific TCR motifs, Molecular responses precede symptoms]
![[Fig4] Human SARS-CoV-2 Challenge Uncovers Local and Systemic Response Dynamics](https://scienceeasyview.com/wp-content/uploads/2024/07/Fig4-Human-SARS-CoV-2-Challenge-Uncovers-Local-and-Systemic-Response-Dynamics-768x504.png)
[Figure 4] 실제 COVID-19 환자 데이터를 통합 및 활용하여 SARS-CoV-2 motif를 발견하다
(a) COVID-19 환자 데이터셋 5개를 통합하여 분석한 UMAP 결과.
(b) COVID-19 환자 데이터셋 5개의 통합본에서 확인 가능한 모든 T 세포 중 활성화된 T 세포의 비율.
(c) UMAP 표현에서 활성화된 T 세포 유형.
(d) TCR 간 distance를 표현한 clustermap 및 여러 참가자들 간에 공통적으로 발견되는 11가지의 shared motif.
(e) SARS-CoV-2에 접종된 참가자들의 접종 후 -1일에서 14일까지 임상데이터 측정치 및 증상을 평균화한 것.
[Figure 4a, b, c, d: Public SARS-CoV-2-specific TCR motifs]
PBMC에서의 2차 면역 반응에 대해 앞서 연구한 내용으로 COVID-19 환자의 데이터를 분석할 때 활성화된 T cell 상태와 관련된 SARS-CoV-2 특이적 TCR 레퍼토리를 연구하는 데 활용을 시도했습니다. 이를 위해 대규모 PBMC 연구 총 5개의 데이터를 deep generative model(scVI)를 통해 통합했습니다. 그 결과, 수백 명의 사람들을 대상으로 약 1백만 개의 T cell 정보를 얻었습니다.
해당 통합 데이터에, human challenge model 연구에서 활용한 cell-type annotation을 적용했습니다. (4a, 4c) 이를 통해 일반적인 감염 환자들도 activated T cell을 보유하고 있다는 것을 확인했고, 이러한 activated T cell은 어느 정도 유사한 특징을 가지고 clustering된다는 것을 확인했습니다.
(4b) COVID-19 환자와 COVID-19에서 회복된 사람들의 샘플에서 activated T cell의 비율이 건강한 사람들에 비해 유의미하게 높았습니다. 이 결과는 이러한 세포들이 COVID-19에 대한 면역 반응에 관여하고 있음을 강조합니다.
(4d) Cell2TCR을 통해 활성화된 clonotype을 파악했을 때, 통합 데이터 및 human challenge model 간 총 266가지의 clonotype 집단이 공유되는 것을 확인했습니다. 이들은 SARS-CoV-2에 대항하는 대표적인 항체 군으로 볼 수 있습니다.
[Figure 4e: Molecular responses precede symptoms]
Single cell 해상도로 분석한 면역 반응의 시간 경과가 COVID-19 환자에서 일반적으로 관찰되고 측정되는 임상적인 특징과 어떻게 관련되는지 조사한 결과입니다.
1. 초기 증상 발현 시점: 지속적 감염에서 초기 증상(코막힘, 인후통)이 주로 접종 후 4일째에 나타남.
2. 후각 상실: 접종 후 8일째부터 지속적 감염 참가자 대부분이 후각을 잃었고, 재채기와 코막힘이 악화됨.
3. 염증성 단백질(CRP) 증가: 접종 후 5일째에 C-반응성 단백질(CRP)이 혈액에서 세 배로 증가함.
Disscussion
이 연구는 인체 감염 모델을 사용하여 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 상세히 분석했습니다. 이를 통해 국소 및 전신 면역 반응의 시간적 순서와 특이성을 명확히 밝혔습니다. 특히, interferon 반응 유전자, MAIT 세포, 염증성 단핵구의 초기 활성화가 임상 증상이 나타나기 전에 관찰되었으며, 이는 초기 면역 반응이 바이러스 감염을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 이러한 발견은 초기 감염 탐지 및 개입을 위한 biomarker로서의 잠재력을 제시합니다.
또한, SARS-CoV-2에 대한 다양한 세포 유형의 반응을 새로운 시각에서 이해할 수 있는 기회를 제공했습니다. Hyperinfected된 섬모 세포는 전체 감염 세포의 작은 부분을 차지하지만, 바이러스 부하의 대부분을 차지하여 바이러스 전파에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 또한, 지속적 감염에서 특정 TCR 및 BCR 클론형의 존재를 발견하여, 이는 표적 면역치료와 백신 개발에 중요한 정보를 제공합니다.
마지막으로, 단일 세포 데이터와 임상 증상을 통합하여 질병 진행의 상세한 타임라인을 제공했습니다. 이러한 분자적 이벤트와 임상 증상 간의 상관관계는 치료 시점을 이해하는 데 도움이 되며, 효과적인 치료 전략을 개발하는 데 기여할 수 있습니다. 이 연구 결과는 초기 면역 반응과 그들의 질병 관리 및 예방에 대한 함의를 탐구하기 위한 추가 연구의 필요성을 강조합니다.